响应面法优化金樱子多糖微波辅助提取工艺

曾庆华+孙小凡+樊琛+齐鑫+李燕+叶勇+刘军海+曾庆梅

摘要：为了优化金樱子（Rosa laevigata Michx.）多糖的提取工艺，采用微波辅助提取方法，以去离子水为溶剂提取金樱子中多糖成分，并以多糖成分提取率为考察指标，通过单因素试验和响应面试验来探讨和优化金樱子多糖的提取工艺，得到金樱子多糖的最佳提取工艺条件为微波时间3.5 min，微波功率438 W，料液比为1∶27（g∶mL），浸提1次。在此提取工艺条件下，金樱子多糖实际提取率可达52.0%。

关键词：金樱子（Rosa laevigata Michx.）；多糖；微波辅助法；单因素试验；响应面试验

中图分类号：TS207.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）17-3314-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.17.032

Optimization of Polysaccharide from Rosa laevigata Michx. Extraction Using Microwave Extraction by Response Surface Methodology

ZENG Qing-hua1，2，SUN Xiao-fan1，FAN Chen1，QI Xin1，LI Yan1，YE Yong2，LIU Jun-hai1，ZENG Qing-mei2

（1.Department of Food Science and Engineering，Liaocheng University，Liaocheng 252059，Shandong，China；

2.School of Food Science and Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China）

Abstract： In order to optimize the extraction process of polysaccharide from Rosa laevigata Michx.，the method of microwave-assisted extraction technology was adopted by using distilled water as the solvent and the extraction rate of polysaccharide as the index. Microwave time，microwave power， ratio of material to liquid and microwave extraction times were studied. Based on the single factor experiment，the extraction process of polysaccharide from Rosa laevigata Michx. polysaccharide was optimized by using the central combination experiment design. The influence factor of the process was determined by regression analysis，and the extraction rate of polysaccharide was determined by the factor of 3. The results showed that the optimum extraction conditions were as follows：the ratio of material to liquid of 1∶27（g∶mL），microwave time of 3.5 min，microwave power of 438 W，extraction of 1 time，the actual extraction rate of polysaccharide was 52.0%.

Key words： Rosa laevigata Michx.；polysaccharide；microwave-assisted extraction；single factor experiments；response surface methodology

金櫻子（Rosa laevigata Michx.），又名糖罐子、白玉带、黄茶瓶、刺头、倒挂金钩等，是蔷薇科蔷薇属的一种野生常绿蔓性灌木。其适宜生长环境对土壤要求不严，阳坡为宜，喜欢温暖湿润和阳光充足的环境，主要分布在中国华东、华中、华南及西南等地[1]，贵州最为丰富。其果实可以入药，具有补肾、利尿的作用，2015年版第一部《中国药典》[2]将金樱子果实收录其中；其叶有消肿、解毒的作用；根药用可以活血散瘀、拔毒驱湿。《本草纲目》记载金樱子“性酸、涩、平，无毒；主治脾泻下痢、止小便利、涩精气；久服，令人耐寒轻身，补血益精有奇效”[3]。在医学上，金樱子可以用于治疗神经衰弱、抑菌消毒、腹泻、高血压病、慢性肾炎、抗动脉粥样硬化、皮肤癌、早期宫颈癌等病症[4-7]。研究表明，金樱子的活性成分可以促进心肌细胞生成，对治疗心肌梗死有良好效果[8]，其提取物对痤疮丙酸杆菌和脂多糖诱导的急性肝损伤也有显著作用[9]。2002年，中国卫生部又公布金樱子为可用于保健食品的原料[10]。另外还有研究证明，金樱子的果实中含有丰富的黄酮、金樱子多糖等物质，这些物质不但可以起到明显的清除自由基、抗炎的作用，而且可以提高机体免疫力。所以金樱子被广泛应用于保健食品和医药领域，具有广阔的市场前景。

多糖是金樱子的重要营养成分之一，对于金樱子多糖的研究越来越多，也证明了其活性和作用。张庭廷等[11]研究证明了金樱子多糖对于常见细菌如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等具有很强的抗菌活性，且对二甲苯引起小鼠的毛细血管通透性增强等炎症有显著的抑制作用。研究还发现金樱子多糖具有调节血脂、降血胆固醇、抗氧化、抗病毒等作用，临床上对普通感冒、烫伤烧伤、直肠壁下移及各种妇科疾病等取得较好的治疗效果[12，13]。目前，国内外学者对金樱子多糖的药理作用、化学成分研究的比较深入，而对于其提取纯化工艺的研究还处于初级阶段，提取工艺仍有很多不足，如提取效率较低、操作成本较高、控制条件严苛等。因此，优化金樱子多糖提取工艺，降低成本、简化操作，同时保证金樱子多糖的质量，是目前研究金樱子多糖提取工艺的目标。endprint

金樱子多糖为大分子化合物，易溶于水，通常采用水提醇沉法[14]、碱提取法[15]、酸提取法[16]，但前者所用时间较长，提取率也不高；而后两者由于多糖不耐酸碱，会使部分多糖分解，所以也存在一定的不足。现发展出用超声波和微波辅助多糖提取法，微波辅助提取法节省溶剂、用时短、提取率高[17，18]。文全泰等[19]利用纤维素酶提取金樱子多糖，正交设计优化的酶解法在一定程度上提高了多糖的提取率，但成本太高，对于温度的控制要求也严格。潘廷啟等[20]利用超声波辅助提取金樱子多糖，不仅增加了提取率、缩短了提取时间，还避免了高温对提取成分的影响。试验证明，超声波辅助法用于提取多糖能够明显提高多糖的提取率，提取时间短，可以简化提取流程、减少杂质、节约成本，在实际操作中具有很大的优点。本研究采用响应面试验确定微波辅助法浸渍提取工艺中各因素的最佳参数，旨在为大规模工业化提取金樱子多糖提供方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金樱子：产地山东，购于山东聊城市利民大药店；苯酚、硫酸、甲醇等试剂均为分析纯；葡萄糖；去离子水。

1.2 仪器与设备

微波合成/萃取工作站（上海新仪微波化学科技有限公司）、TU-1810型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）、电子天平（奥豪斯国际贸易上海有限公司）、超声波清洗器、循环水式多用真空泵、100 mL微波仪专用三颈烧瓶、10 mL容量瓶、100 mL容量瓶。

1.3 试验方法

1.3.1 金樱子多糖成分的提取方法

1）金樱子多糖提取工艺流程：干燥的金樱子→粉碎后过20目筛→用去离子水浸泡提取→微波提取→抽滤→滤液进行定容→测定吸光度[21]。

2）金樱子多糖提取操作要点：将干燥的金樱子样品用中药粉碎机进行粉碎，然后过20目筛。称取粉碎过筛后的样品2.000 0 g，加入100 mL微波仪专用烧瓶中，最后加入一定料液比的去离子水，浸泡12 h后，在设定参数下进行微波提取，提取后进行抽滤，得到的滤液用去离子水定容到100 mL容量瓶中，摇匀。取上述溶液0.1 mL加入10 mL刻度试管中，调节水浴锅温度到99 ℃，将试管放入水浴锅中将水分蒸干，加甲醇1 mL溶解备用。

1.3.2 定量分析

1）标准曲线制备：葡萄糖于105 ℃下干燥至恒重，并准确称取36.6 mg，于100 mL容量瓶中，去离子水溶解并定容、摇匀，得到葡萄糖標准溶液。精密吸取葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，然后分别加入去离子水补至2 mL，然后再分别加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速加入5.0 mL浓硫酸，摇匀，在40 ℃水浴锅中水浴15 min，然后用冷水冷却10 min，同时以2.0 mL去离子水为空白，用分光光度计测定标准溶液在波长480 nm下的吸光度并记录，得到标准曲线方程C=19.800A-0.857 3，相关系数r=0.992[22]。

2）金樱子多糖提取液的测定：采用苯酚-硫酸法，精密吸取样品溶液1.0 mL置于100 mL容量瓶中，并加水稀释定容，再吸取1 mL到另一100 mL容量瓶中。然后精密量取1 mL置于10 mL容量瓶中，加去离子水补至2 mL，再加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速加入5.0 mL浓硫酸，摇匀，在40 ℃水浴锅中水浴15 min，然后用冷水冷却10 min，同时以2.0 mL去离子水为空白，用分光光度计测定标准溶液在波长480 nm下的吸光度并记录，多糖提取率用以下公式计算：

1.3.3 单因素试验

1）微波时间对金樱子多糖提取率的影响。准确称取2.00 g金樱子粉末置于100 mL微波仪专用三颈烧瓶中，固定微波功率为400 W，料液比为1∶20（g∶mL，下同），提取次数为1次。在微波中加热回流，微波时间分别为1、2、3、4、5、6 min。按照上述条件和步骤分别提取。

2）微波功率对金樱子多糖提取率的影响。准确称取2.00 g金樱子粉末置于100 mL微波仪专用三颈烧瓶中，固定微波时间为3 min，料液比为1∶20，提取次数为1次。在微波中加热回流，微波功率分别为100、200、300、400、500、600、700 W。按照上述条件和步骤分别提取。

3）料液比对金樱子多糖提取率的影响。准确称取2.00 g金樱子粉末置于100 mL微波仪专用三颈烧瓶中，固定微波时间为3 min，微波功率为400 W，提取次数为1次。在微波中加热回流，料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35。按照上述条件和步骤分别提取。

4）提取次数对金樱子多糖提取率的影响。准确称取2.00 g金樱子粉末置于100 mL微波仪专用三颈烧瓶中，固定微波时间为3 min，微波功率为400 W，料液比为1∶20。在微波中加热回流，提取次数分别为1、2、3、4次。按照上述条件和步骤分别提取。

1.3.4 响应面试验 根据单因素试验和金樱子多糖常规提取方法选定微波时间、料液比、微波功率作为考察的因素，固定提取次数为1次，以单因素试验为基础，采用三因素三水平响应面法（表1），对金樱子多糖的微波提取进行分析优化。

2 结果与分析

2.1 微波辅助法提取金樱子多糖的单因素试验

2.1.1 微波时间对金樱子多糖提取率的影响 由图1可以看出，起初延长加热时间可以促进多糖的溶解，4 min左右多糖提取率达到最高值，继续加热，由于易发生多糖水解，导致提取率下降，从节约能源、保证金樱子多糖质量方面考虑，微波时间在4 min左右为宜。

2.1.2 微波功率对金樱子多糖提取率的影响 由图2可以看出，在微波功率为400 W时多糖的提取率最大。由于多糖在提取过程中可以发生水解反应，且微波容易破坏生物质，从而改变多糖的性质，因此试验功率在400 W左右，可得到提取率较高的多糖。endprint

2.1.3 料液比对金樱子多糖提取率的影响 由图3可以看出，料液比对金樱子多糖提取率具有明显影响，随着料液比增加，多糖扩散溶解速度加快，但料液比过大会导致后续蒸发时间过长。由图3可知，随着料液比的增大，提取率缓慢增加，但到达1∶25时基本达到最大，继续增加则提取率变化不稳定，所以料液比以1∶25左右为宜。

2.1.4 提取次数对金樱子多糖提取率的影响 由图4可以看出，随着提取次数的增多能增加金樱子多糖的提取总量，在提取两次后，提取率已接近一常数，但从节省能耗、简化操作以及减少提取时间等方面考虑，提取次数取1次为宜[23，24]。

2.2 微波辅助法提取金樱子多糖的响应面试验

由以上单因素试验影响结果分析，固定提取次数为1次，选取微波时间、料液比和微波功率为影响金樱子多糖提取率的3个因素，根据Box.Benhnken的中心组合试验设计原理，在单因素试验的基础上进行三因素三水平响应面试验。

对微波时间、料液比、微波功率作如下变换X1=（t-4）/1，X2=（z-25）/5，X3=（w-400）/100，在试验设计与结果中，其中析因试验为1～12，中心试验为13～15，以校正试验结果、减少试验误差。式中t、z、w分别表示微波时间、料液比、微波功率的真实值，采用SAS RSREG程序进行响应面分析试验，试验设计与结果如表2所示。

使用The SAS System 8.0程序对响应值与各因素进行回归拟合，分析试验结果得到其响应面与等高线，见图5～图7。

由图5可知，当微波功率一定时，提取率随微波时间与料液比的变化趋势明显，先升高后降低，达到最高点后明显下降。

由图6可知，当料液比一定时，提取率随微波时间与微波功率的变化趋势明显，先升高后降低，达到最高点后明显下降。

由图7可知，当微波时间一定时，提取率随料液比与微波功率的变化趋势明显，先升高后降低，达到最高点后明显下降。

由表3可知，回归模型也是显著的。该模型相关系数R2=98.32%，说明该模型与实际试验拟合度较高。因此，回归方程可以较好地描述料液比、微波时间和微波功率对多糖提取率的实际影响，可利用回归方程确定最佳工艺条件。

回归方程：Y1=0.521-0.024 375X1+0.038 5X2+0.077 875X3-0.037 5X12-0.002 25X1X2-0.023 5X1X3-0.056 25X22+0.037 25X2X3-0.141X32。對回归方程取一阶偏导数等于零，整理可得如下三式：

0=-0.024 375-2×0.037 5X1-0.002 25X2-0.023 5X3

（1）

0=0.038 5-0.002 25X1-2×0.056 25X2+0.037 25X3

（2）

0=0.077 875-0.023 5X1+0.037 25X2-2×0.141X3

（3）

式（1）、（2）、（3）联立方程组，解得X1=-0.457 49，X2=0.476 263，X3=0.377 187，代入前述的变换公式得到，微波时间t=3.542 5 min，料液比z=1∶27.381 3，微波功率w=437.718 7 W，将所得值修正即得多糖提取工艺最佳条件为料液比1∶27，微波功率438 W，微波时间提取3.5 min，提取1次。在此修正条件下，实际测得提取率为52.0%。

2.3 验证试验

由响应面试验结果分析可以得到，微波辅助法提取金樱子多糖成分的最佳工艺条件为料液比 1∶27，微波功率438 W，微波时间提取3.5 min，提取1次。为进一步精确试验结果进行验证试验，获得吸光度，按照公式计算得到，在此条件下金樱子多糖成分的3次平均提取率为51.9%。

3 结论

采用微波辅助提取方法，用去离子水为溶剂提取金樱子中多糖成分，并以多糖成分提取率为考察指标，通过单因素试验和响应面试验来探讨和优化金樱子多糖的提取工艺，最后得出金樱子多糖的最佳提取工艺条件为微波时间3.5 min，微波功率438 W，料液比为1∶27，浸提1次。在此提取工艺条件下，金樱子多糖实际一次提取率可达52.0%。但其含量测定方法是用的紫外分光光度计法，因试验试剂欠缺，此方法测定含量结果偏低，不过在一定程度上能反映多糖的含量[26]。

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