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介离子杀虫剂:调节烟碱乙酰胆碱受体的新颖类别杀虫剂

2017-10-13王昌钊付骋宇编译

世界农药 2017年3期
关键词:丙二酸苯基烟碱

王昌钊,付骋宇 编译



介离子杀虫剂:调节烟碱乙酰胆碱受体的新颖类别杀虫剂

王昌钊,付骋宇 编译

(陕西出入境检验检疫局,西安 710068)

到2050年世界人口将达到90亿,估计粮食生产需要增加60%才能满足需求。粮食生产增加的很大部分需要使用安全有效的杀虫剂来减少害虫造成的损失来保证。而面临的挑战就是现有杀虫剂抗性的不断发展,这就需要开发新类别的杀虫剂。开发能够防治抗性害虫的新化学类别的杀虫剂将会对农业和世界食品安全做出重要贡献。

之前介离子化合物还没有被开发用于农业,因此是农药领域中全新的化学类别。本文介绍了triflumezopyrim(1) (DuPontTMPyraxaltTM)和dicloromezotiaz(2) (图1)的发现和优化,这2个物质作用于昆虫的烟碱乙酰胆碱受体而具有杀虫活性。

图1 triflumezopyrim(1)和dicloromezotiaz (2)的化学结构

自烟碱被使用后,乙酰胆碱受体就一直为杀虫剂防治害虫的重要神经元靶标。近年,新烟碱类杀虫剂是高效的昆虫控制剂。烟碱和新烟碱与内源性神经递质乙酰胆碱结合于同一位点,被称为烟碱乙酰胆碱受体的正构位点。新烟碱类杀虫剂的第一个产品吡虫啉在1991年引入。目前此类杀虫剂有许多产品上市,其市场销售额约占杀虫剂的25%。Bass等人介绍此类产品在稻飞虱杀虫剂市场中占有重要位置,以及此害虫对此类产品的抗性情况,其抗性在亚洲广泛存在。

Triflumezopyrim(1)有望成为防治亚洲水稻飞虱敏感和抗性品系的有效工具。Diclorome-zotiaz(2)有可能成为防治鳞翅目害虫的药剂,特别是考虑到结合于烟碱乙酰胆碱受体正构位点的杀虫剂未被充分用于防治鳞翅目害虫。

介离子杀虫活性的发现起源于一个杀菌剂被优化为丙氧喹啉(proquinazid)过程中的副产物,这些副产物没有杀菌活性,故在当时未被继续研究。然而,后来发现其中一个副产物,即化合物3有杀虫活性(表1),故进行了优化,下文对此作了介绍。

介离子化合物较罕见,还没有开发用于作物保护。在此对其进行了定义,即介离子为五或六元杂环偶极化合物,在不进行电荷分离的情况下无法用传统的价键结合形式绘制其结构,也不能以单个典型结构表示。图2列出了triflumezopyrim(1)负离子的互变异构体为例。这些化合物被认为是非苯系芳族物。本文讨论的介离子化合物为pyrimidinium olate类。本文讨论了介离子杀虫剂的合成、优化和作用机制。

图2 triflumezopyrim(1)负离子互变异构体

1 材料和方法

1.1 一般合成方法

用标准光谱方法表征所有新化合物。氢核磁共振仪:Varian INOVA 400 MHz核磁共振系统,Nalorac间接检测探头(indirect detection probe);或BrukerAance III 500 MHz 核磁共振系统,BBFOPLUS间接检测探头(indirect detection probe);以氘代溶剂和四甲基硅烷为内标。化学位移在低场(标准TMS, d=0.00),单位ppm。所有反应在无水、惰性气体(氮气或氩气)、干溶剂条件下进行。

表1 介离子结构

1.2 目标化合物的合成

在惰性溶剂中,在加热条件下2-氨基吡啶取代物和丙二酸发生反应,较方便地制得六元介离子物,此合成方法见图3。一般可通过典型的Claisen缩合反应丙二酸酯芳基化或苯乙酸衍生物的酰化制备丙二酸(图4)。丙二酸二烷基酯碱解,再制备酰基氯,二者与2,4,6-三氯苯酚反应制得2,4,6-三氯苯酯。碘苯基或溴苯基丙二酸的Suzuki芳基化,或碘苯基或溴苯基乙酸的Suzuki芳基化制取联芳化合物,其再发生酰化形成联苯丙二酸。2-氨基吡啶发生还原胺化反应,或2-卤代吡啶发生取代卤反应,或卤甲基苄基杂环发生取代卤反应生成2-氨基吡啶衍生物(图5)。2-嘧啶甲醛发生还原胺化反应生成嘧啶甲基胺。

1.2.1 氨基吡啶中间体的制备

1.2.1.1-[(2-氯噻唑-5-基)甲基]-3-甲基吡啶-2-胺

在试管中加入-甲基吡咯烷酮(10 mL)、2-氨基-3-甲基吡啶(2.16 g,20 mmol)和2-氯-5-氯甲基噻唑(1.68 g,10 mmol),封口。用Biotage微波系统加热,在220 ℃反应10 min。然后把反应液倒入100 mL的饱和NaHCO3水溶液中,分别用50 mL乙酸乙酯萃取3次。干燥(Na2SO4)、浓缩有机相,用硅胶柱对残留物进行色谱分离(乙酸乙酯︰正己烷=1︰9)得到目标化合物。1H NMR (CDCl3)δ8.07 (d,1H),7.43 (s,1H),7.26 (d,1H), 6.63 (dd,1H), 4.77 (d,2H), 4,54 (br,s,1H)。

图3 环化反应

图4 丙二酸制备路线

图5 氨基吡啶的制备路线

1.2.1.2-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]吡啶-2-胺

在试管中加入-甲基吡咯烷酮(10 mL)、2-氟吡啶(1.47 g,15 mmol)和5-氨基甲基吡啶(1.4 g,10 mmol),封口。用Biotage微波系统加热,在200 ℃反应30 min。然后把反应液倒入100 mL的饱和NaHCO3水溶液中,分别用50 mL乙酸乙酯萃取3次。干燥(Na2SO4)、浓缩有机相,用硅胶柱对残留物进行色谱分离(乙酸乙酯︰正己烷=1︰9)得到目标化合物。1H NMR (CDCl3)δ8.37 (s,1H), 8.07 (d,1H),7.66 (d,1H), 7.42 (t,1H), 7.26 (d,1H), 6.92(t,1H),6.40 (d,1H), 5.20 (br,s,1H), 4.55 (d,2H)。

1.2.2-(嘧啶-5-基甲基)吡啶-2-胺

1.2.2.1 反应步骤A:制备-(5-嘧啶亚甲基)-2-吡啶胺

把2-氨基吡啶(11.31 g,120.3 mmol)和吡啶-5-甲醛(14.0 g,129.6 mmol)的氯仿(300 mL)溶液在室温搅拌反应15 min。减压去除易挥发物质(75 ℃,1 h),得到黄色固体。溶解此物体,搅拌,去除挥发物质,如此重复处理2次以上。最后得到的黄色固体在80 ℃真空条件下过夜干燥,得到22.09 g(99.8%)的目标化合物。1H NMR (CDCl3)δ 9.26-9.32 (m,4H), 8.52 (d,1H),7.82 (t,1H),7.42 (d,1H), 7.26 (t,1H)。

1.2.2.2 反应步骤B:-(嘧啶-5-基甲基)吡啶-2-胺的合成

把98%的硼氢化钠粉末(2.87 g,75.5 mmol)加入甲醇(80 mL)和四氢呋喃(400 mL)溶液中,用力搅拌5 min。把反应步骤A的产物(13.9 g,75.5 mmol)溶解于400 mL的四氢呋喃中,把所得溶液点滴加入硼氢化钠悬浮液中。搅拌直到起始反应物质消失。再加入乙酸(2 mL),搅拌反应5 min。加入乙酸(2 mL)、水(30 mL)和乙酸乙酯(500 mL),用1 N氢氧化钠水溶液(300 mL)冲洗反应混合物,干燥(MgSO4),过滤,减压去除溶剂。把得到的油状物溶解于二氯甲烷(50 mL)中,通过硅胶(100 g)塞用乙酸乙酯(3L)洗提。减压浓缩洗提液得到油状物,缓慢结晶得到8.91 g (63.4%)浅黄色固体目标化合物。1H NMR (CDCl3)δ 9.12(s,1H), 8.76 (s,2H), 8.10 (d,1H), 7.42 (t,1H), 6.64 (t,1H), 6.42 (d,1H), 4.99(br s,1H), 4.61 (d,2H)。

1.2.3 苯丙二酸中间体的制备

1.2.3.1 双(2,4,6-三氯苯基)2-[3-(三氟甲基)苯基]丙二酸的制备

步骤A:2-[3-(三氟甲基)苯基]丙二酸二乙酯的合成

用氮气净化二氧六环(100 mL)10 min,然后加入1,10-邻二氮杂菲(1.0 g)和碘化亚铜(1.0 g)。在氮气保护下搅拌悬浮液5 min,加入碳酸铯(18.72 g,57.45 mmol)、丙二酸二甲酯(5.46 g,50.6 mmol)和1-碘-3-(三氟甲基)苯(12.5 g,46.0 mmol)。加热回流18 h,冷却到室温,用1 N HCl水溶液淬灭反应。分离有机层和水层。用乙酸乙酯(3×100 mL)萃取水层,合并有机相,干燥(MgSO4),过滤,用Celite®浓缩,以100%正己烷-25%乙酸乙酯的正己烷梯度溶液洗脱,用硅胶色谱纯化得到7.36 g(58.0%)的目标产物。1H NMR (CDCl3)δ 7.59-7.65(m,3H),7.49 (t,1H),4.70 (s,1H), 3.76(s, 6H)。

反应步骤B:双(2,4,6-三氯苯基)2-[3-(三氟甲基)苯基丙二酸的制备

把反应步骤A所得产物加入NaOH(25 g)水(75 mL)溶液中,60 ℃氮气保护下用力搅拌反应液8 min。然后把反应液加入冰(100 g)中,用6 N HCl水溶液把pH调至1,用乙酸乙酯(3×100 mL)萃取。合并有机萃取物,干燥(MgSO4),过滤,减压浓缩。把二氯甲烷(200 mL)加入所得白色固体中,再加入草酰氯(5 mL)和,-二甲基甲酰胺(0.5 mL)。在室温搅拌反应液2 h,加入2,4,6-三氯苯酚(10.528 g,53.32 mmol)。室温搅拌过夜,减压浓缩。在残留物中加入甲醇,慢慢析出固体。过滤得到8.161 g(50.43%)固体目标化合物。1H NMR (CDCl3)δ 7.91(s,1H),7.83(d,1H),7.70 (d,1H),7.59 (t,1H), 7.37 (s,4H),5.38 (s,1H)。

1.2.4 双(2,4,6-三氯苯基)2-(3,5-二氯苯基)丙二酸的制备

1.2.4.1 步骤A:2-(3,5-二氯苯基)丙二酸二乙酯的制备

把碳酸铯(3.6 g,11 mmol)、1,10-邻二氮杂菲(198g,1.1 mmol)和Cul(209 mg,1.1 mmol)加入二氧六环(29 mL)中,在氮的保护下搅拌15 min,再加入3,5-二氯碘苯(3.0 g,11 mmol)和丙二酸二乙酯(1.66 mL,1.75 g,11 mmol)。把反应系统抽成真空,在搅拌回流条件下用氮净化过夜。冷却反应混合液,加入1 N HCl。用乙酸乙酯萃取3次,合并有机层并干燥(MgSO4),浓缩,用硅胶色谱纯化,得到2.56 g纯的目标化合物。1H NMR (CDCl3)δ 7.31-7.34(m,3H),4.54(s,1H),4.23 (q,4H),1.28 (t,6H)。

1.2.4.2 步骤B:双(2,4,6-三氯苯基)2-(3,5-二氯苯基)丙二酸的制备

把2-(3,5-二氯苯基)丙二酸二乙酯(305 g,1 mmol)加入5 mL 20%氢氧化钠水溶液中,在70 ℃搅拌30 min,冷却,用6 N HCl中和。用乙酸乙酯萃取,干燥萃取液(Na2SO4),浓缩,得到210 mg的二酸。在二氯甲烷(2 mL)中加入草酰氯(0.17 mL,0.26g,2.0 mmol)和一滴DMF,搅拌下再加入所得二酸。继续搅拌1 h,加入2,4,6-三氯苯酚(394 mg,2 mmol),搅拌过夜。浓缩,得到所需的二酯和2,4,6-三氯苯酚混合液,用于下一步反应。

1.2.5 2-[3-(5-氯-2-氟-苯基)苯基]丙二酸二乙酯的制备

1.2.5.1 步骤A:2-[3-(5-氯-2-氟-苯基)苯基]乙酸乙酯的制备

把3-碘苯乙酸乙酯(1.45 g,5 mmol)、5-氯-2-氟苯硼酸(1.04 g,6 mmol)、PdCl2(PPH3)2(175 mg,0.25 mmol)和3 mL 2N Na2CO3水溶液加入6 mL二氧六环中,溶解,用Biotage微波系统加热到160 ℃并维持5 min。反应混合液分散为水和乙酸乙酯相,并分离,用乙酸乙酯萃取水相,合并有机相,干燥(Na2SO4),硅胶色谱(乙酸乙酯︰正己烷=1︰9)纯化,得到1.0 g无色油状物。1H NMR (CDCl3)δ 7.39-7.45(m, 4H), 7.32(m, 1H), 7.26 (m, 1H), 7.08 (dd, 1H), 4.17(q, 2H), 3.67(s,2H), 1.26(t,3H)。

1.2.5.2 步骤B:制备2-[3-(5-氯-2-氟-苯基)苯基]丙二酸二乙酯

把步骤A产物(1.0 g,3.4 mmol)溶解于10 mL的碳酸二乙酯中,再加入氰化钠(544 mg的60%(质量比)矿物油,13.6 mmol)。在常温搅拌过夜,用饱和氯化铵水溶液淬灭反应,用乙酸乙酯萃取。干燥有机层(Na2SO4),蒸发产生1.2 g灰色油状目标化合物。1H NMR (CDCl3)δ 7.56(s,1H), 7.48(m,1H), 7.40-7.46 (m, 3H), 7.25-7.28(m, 1H), 7.09(dd, 1H), 4.67(s,1H), 4.19(q,4H), 1.31(t,6H)。

1.2.6 介离子杀虫剂的制备

1.2.6.1 化合物1的制备:(4-oxo-(pyrimidin-5-ylmethyl)-3- [3-(trifluoromethyl)phenyl]pyrido[1,2-a]pyrimidin-1-ium-2-olate

在双(2,4,6-三氯苯酚)2-[3-(三氟甲基)苯基]丙二酸(8.16 g,13.4 mmol)的甲苯(100 mL)溶液中加入-(嘧啶-5-基甲基)吡啶-2-胺(3.31 g,17.8 mmol)。加热到110 ℃,维持6 h,用Celite®浓缩,以100%乙酸乙酯-20%甲醇的乙酸乙酯的梯度溶液洗脱,用硅胶色谱纯化得到7.36 g(58.0%)的目标产物。

1.2.6.2 化合物2的制备:1-[(2-chlorothiazol-5-yl) methyl]- 3-(3,5-dichlorophenyl)-9-methyl-4-oxo-pyrido[1,2-a]pyrimidin-1-ium-2-olate

在1 mL甲苯中加入-[(2-氯噻唑-5-基)甲基]-3-甲基–吡啶-2-胺(100 mg,0.4 mmol)和双(2,4,6-三氯苯基)2-(3,5-二氯苯基)丙二酸(300 mg,含有一些2,4,6-三氯苯酚),加热到70 ℃,维持2 h。用Celite®浓缩,用硅胶色谱(50%~100%乙酸乙酯正己烷溶液)分离得到25 mg黄色固体目标产物。

1.2.6.3 化合物23的制备:3-[3-(5-chloro-2-fluoro-phenyl) phenyl]-1-[(2-dichlorothiazol-5-yl)methyl]-4-oxo-pyrido[1,2-za]pyrimidin-1-ium-2-olate

把2-[3-(5-氯-2-氟苯基)苯基]丙二酸二乙酯(1.2 g,3.3 mmol)加入10 mL的NaOH(20%)水溶液中,搅拌加热10 min。冷却,用6 N HCl淬灭反应,且把pH调至2,然后用乙酸乙酯萃取。用盐水洗涤有机层,干燥(Na2SO4),浓缩得到0.8 g白色固体,立即用于以下反应。

把2-[3-(5-氯-2-氟苯基)苯基丙二酸(200 mg,0.65 mmol)溶解于3 mL二氯甲烷中,然后加入草酰氯(0.3 mL,0.45 g,3.5 mmol)和一滴DMF。在常温搅拌反应30 min,浓缩。把浓缩物溶解于3 mL的二氯甲烷中,冰浴冷却。然后加入-[(2-氯噻唑-5-基)甲基]吡啶-2-胺(100 mg,0.44 mmol)和三乙胺(0.3 mL,0.4 g,0.4 mmol)。在冰浴中搅拌反应15 min,用Celite®浓缩,色谱(50%~100%乙酸乙酯正己烷溶液)纯化得到110 mg目标产物。

1.3 杀虫剂的测试

1.3.1 制剂和喷雾方法

在测试化合物中加入10%丙酮、90%水和300 mg/L X-77®Spreader L0-Foam Formula非离子表面活性剂,此表面活性剂含有烷基芳基聚氧乙烯、游离脂肪酸、乙二醇和异丙醇。喷雾器在受试对象上方1.27 cm处喷施1 mL的测试化合物溶液。稻飞虱用药量为50、10、0.4 mg/L,喷雾后干燥2 h;其他受药对象的用药量为250、50、10、2、0.4 mg/L,药后干燥1 h。每个处理重复3次。

1.3.2 鳞翅目害虫

评估化合物对小菜蛾()和草地贪夜蛾()的活性试验中,每个小的开放容器中种植一株植物,在一株12~14d的芥子植物或4~5 d的玉米上接种约50头刚孵化小菜蛾幼虫或10~15头孵化1 d的草地贪夜蛾幼虫后,喷测试化合物药液。在25 ℃,相对湿度70%的培养箱中培养6 d。用肉眼评估植物被取食情况,确定防效≥90%的浓度(LC90)。

1.3.3 飞虱

评估化合物对玉米花翅飞虱()和马铃薯小绿叶蝉()的活性试验中,每个小的开放容器中种植有一株3~4 d的玉米或5 d的Soleil豆(长出主要的叶),在土壤上面添加白沙,在喷雾之前切除一片主要的叶子。喷雾后,每株植物上接种15~20头玉米花翅飞風若虫(18~21 d)或5头马铃薯小绿叶蝉成虫(18~21 d)。在植株上面罩一黑色屏蔽盖,在培养箱(22~24 ℃,相对湿度50%~70%)培养6 d。肉眼评估昆虫死亡情况。

评估化合物对二点黑尾叶蝉()和褐飞虱()的活性试验中,在一个塑料盆中种有一株13 cm的水稻植株,用钢丝网罩住(50目)。喷雾后,干燥2 h,接种10头二点黑尾叶蝉(3龄若虫,孵化后7~9 d)。5 d后肉眼评估防治情况,确定防效≥90%的浓度(LC50)。

1.3.4 蚜虫

评估化合物对桃蚜()和棉蚜()的活性试验中,每个小的开放容器中种植一株植物,在一株12~15d的萝卜或6~7d的棉花上放置一片有30~40头蚜虫的叶片接种。接种后,在培养土壤上覆盖一层沙子。在植株上面罩一黑色屏蔽盖。在19~21 ℃,相对湿度50%~70%的培养箱中培养6 d。用肉眼评估防治情况,确定防效≥90%的浓度(LC90)。

1.4 蜚蠊注射研究

在美国蜚蠊()的成雄虫节间膜注射不同浓度的试验化合物的DMSO溶液(2μL),48 h内观察中毒症状和死亡情况。

1.5 对昆虫神经元的电压钳位的研究

在含有150 mM NaCl、3 mM KCl、10 mM葡萄糖、10 mM HEPES,pH 7.2的解剖液中对蜚蠊成虫或烟蚜夜蛾()幼虫的胸神经节机械脱髓鞘。在胶原酶(Sigma-Aldrich C2674, 0.5 mg/mL)+玻黏胺糖酸酶(Sigma-Aldrich H3506, 1.0 mg/mL)或胶原酶(Sigma-Aldrich C2674, 0.125 mg/mL)+分散酶(Sigma-Aldrich D4818,0.5 mg/mL)中27 ℃培养神经节30 min。然后在解剖液中加入10%胎牛血清、5 mM CaCl2、100单位/mL青霉素+0.1 mg/mL链霉素,把神经节移入其中,研磨至细胞分离。把细胞置于用伴刀豆球蛋白A(400 μg/mL)/层粘连蛋白(4 μg/mL)处理的盖玻片上,培养2~3 d后试验。

用内充3 M的KCl的微电极刺穿神经元,钳制电位为-60mV(美国蜚蠊)或-70mV(烟蚜夜蛾),采样频率15 kHz,用不连续单电极电压钳测定。用PClamp8或PClamp10软件(Molecular Devices)处理数据。在解剖生理盐水中加入CaCl2(5 mM)和用于阻断毒蕈碱乙酰胆碱受体电流的阿托品(1 μM),得到记录溶液(recording solution)。用固定于神经节0.8 mm内的灌流管连续不断灌流记录溶液或测试化合物(溶于记录溶液)(1.1~1.5 mL/min)于神经节。每个处理重复3次。

所有介离子化合物都是本研究合成,吡虫啉和啶虫脒购自Chem Service,其他所有药物购自Digma-Aldrich。

2 结果和讨论

2.1 杀虫活性

所讨论的介离子化合物都列于表1,表2为其杀虫活性。

已有文献报道了介离子杀虫剂的早期优化,发现了R3为氯吡啶甲基、氯噻唑甲基或嘧啶甲基的高活性化合物。最初评估这些化合物对鳞翅目害虫小菜蛾和半翅目害虫玉米花翅飞風的杀虫活性,发现化合物3使用浓度为50 mg/L时防效≥90%。在优化过程中,R3从正丙基变为CH3CF3、相关卤代烷基和随后的氯吡啶甲基化合物4和6。这些修饰使化合物对小菜蛾和另一鳞翅目害虫草地贪夜蛾的活性增加;对玉米花翅飞風和另一半翅目害虫马铃薯小绿叶蝉的活性也显著增加。进一步评估发现化合物4对重要水稻害虫褐飞虱和二点黑尾叶蝉有中等活性。氯噻唑甲基化合物7和9对小菜蛾和草地贪夜蛾,以及玉米花翅飞風和马铃薯小绿叶蝉的活性进一步提高,然而对水稻害虫褐飞虱和二点黑尾叶蝉活性没变。

至此,把优化目标分为2个方向,一为提高对水稻飞虱的活性,一为提高对鳞翅目害虫的活性。

对飞虱活性提高的优化集中于对杂环甲基即R3取代,发现了5-嘧啶甲基取代物triflumezopyrim(1)。研究了多种五元和六元芳香和非芳香杂环物,发现未取代的嘧啶比2-氯嘧啶甲基或2-甲基嘧啶甲基物活性更高,特别是对褐飞虱和二点黑尾叶蝉,如triflumezopyrim(1)和12比化合物13(甲基)或11和14(氯代)更高。考虑到已有报道介离子杀虫剂与新烟碱结合于烟碱乙酰胆碱受体的同一位点,此结果就有点奇怪,因为除呋虫胺以外所有的商业新烟碱都有一个芳香杂环甲基团不是被氯吡啶甲基取代就是被氯噻唑甲基取代。

注:a:DBM:小菜蛾;FAW:草地贪夜蛾;CMA:棉蚜GPA:桃蚜;CPH:玉米花翅飞虱;PLH:马铃薯小绿叶蝉;BPH:褐飞虱;GLH:二点黑尾叶蝉。b:1995-1997年敏感种群数据。

在对许多类似物进行广泛的实验室和田间试验后,选择triflumezopyrim(1)作为优异的水稻杀虫剂进行开发。

R3为氯噻唑甲基被证实比其他取代化合物的活性更广谱。所以优化对鳞翅目害虫的活性集中在对R1和R2的取代。通过多种取代研究,发现间位取代杀虫活性最好,所以进一步研究了3-取代和3,5-二取代类似物。

化合物8,9和15-17就是R3为氯噻唑甲基基团的3-单取代类似物。一般,卤代(halo)和拟卤代(pseudo-halo)类似物对小菜蛾和草地贪夜蛾的活性非常好到优异,溴类似物9浓度为0.4 mg/L时在筛选试验中防效>80%。供电子甲氧基类似物17对鳞翅目害虫的活性没有化合物8、9和16高,但对受试的半翅目害虫的活性显著高。

Dicloromezotiaz(2)和18-20是R3为氯噻唑甲基基团的3,5-二取代类似物。化合物18具有供电子集团(甲基和甲氧基),和单取代类似物17的情况一样,与卤代和拟卤代取代物相比,对半翅目害虫的活性稍有提高,而对鳞翅目害虫的活性稍有下降。此类中卤代和拟卤代取代物对鳞翅目具有好到优异的活性,对半翅目害虫的活性变化大。应该指出的是dicloromezotiaz(2)在核环9位有一甲基取代。其取代和作用将在以下讨论。

在对R1和R2进行多种取代研究时,在环的不同位置进行了各种芳基和杂芳基取代。和小基团取代情况一样,3-位取代最有利于提高对鳞翅目害虫的活性,化合物21-23就是例证,它们对小菜蛾和草地贪夜蛾的室内活性最高。

对于大多数讨论的化合物,核左环的取代基R4为氢。在优化的早期,在氮(R3)上没有链接最佳取代基时,对R4进行了各种取代研究。在所有位置进行的各种取代都没有提高化合物的活性。在R3确定为氯噻唑甲基后,再对R4取代进行了研究,发现R4为9-甲基(与碳环链接相毗邻)时对鳞翅目害虫的活性显著提高。如dicloromezotiaz(2)具有9-甲基,化合物20为9-H,对任一受试昆虫dicloromezotiaz(2)的活性要高于化合物20。

2.2 杀虫剂作用机制

对介离子核9-碳位为氢(9-H)的介离子杀虫剂化合物[包括triflumezopyrim(1)]的作用机制研究表明这些杀虫剂对烟碱乙酰胆碱受体具有独特的生理作用,即作用于烟碱乙酰胆碱的正构位点。中毒症状为昆虫不活跃,蜚蠊被注射药液后15~30 min逐渐对刺激没有反应,用探针触碰时,足和躯体的反应极慢。没有发现神经兴奋症状,如足过度伸展、腹部蜷曲、震颤或抽搐。与triflumezopyrim(1)形成对比的是给蜚蠊注射9-碳位为甲基(9-CH3)的介离子化合物后,蜚蠊呈现中等程度的神经兴奋症状。注射dicloromezotiaz(2) (≧6 ng/g体重,每剂量5头虫)1 h内,用探针触碰时蜚蠊足过度伸长,兴奋度增加。随着时间增加,躯体先轻度震颤,然后动作不协调,不能动。此症状表明dicloromezotiaz使烟碱乙酰胆碱受体兴奋而不是抑制。

分离的烟蚜夜蛾胸神经元的全细胞电压钳研究表明triflumezopyrim(1)和dicloromezotiaz (2)在分别以100、10 μM [dicloromezotiaz(2)水溶解极限]标准应用期间(10 s)都没有显著激发烟碱乙酰胆碱受体介导的电流(图6a和6b)。这与啶虫脒对鳞翅目的烟碱乙酰胆碱受体激活作用形成对比(图6c)。有趣的是,虽然暴露于triflumezopyrim(1)后乙酰胆碱诱发的电流能够恢复,但短时间暴露于dicloromezotiaz(2)后,尽管延迟生理盐水冲洗时间(>40 min),诱发电流恢复程度极小(图6b)。

注:所有处理中,100 μM乙酰胆碱(10 s)处理在用生理盐水冲洗前和冲洗4 min的电流反应分别以粗黑线(A)和灰线(B)表示,100 μM triflumezopyrim(1)(a)、10 μM dicloromezotiaz (2)(b)和10 μM啶虫脒处理的电流反应用细黑线(C)表示。直线对应于乙酰胆碱或杀虫剂的应用时间。

考虑到对蜚蠊注射dicloromezotiaz(2)后,出现兴奋性中毒症状,故对分离的蜚蠊胸神经元进行了电压钳研究。如烟蚜夜蛾神经元一样,短时间(10 s)应用dicloromezotiaz(2)不能诱导产生内向电流,随后乙酰胆碱反应被强烈抑制。然而,延长dicloromezotiaz(2) (10 μM)应用时间(6~120 s),虽然内向电流显著,但只在50%的受试神经元中发现(图7)。其平均电流是乙酰胆碱(100 μM)诱导的峰值电流的3.4%±4.5% (n=8)。灌流烟碱乙酰胆碱受体抑制剂甲基牛扁碱能完全阻断dicloromezotiaz(2)的反应,这表明对烟碱乙酰胆碱受体的激活是产生内向电流的原因。延长triflumezopyrim(1)(10 μM)的应用时间,相似地对烟碱乙酰胆碱受体有弱的激活作用(是乙酰胆碱反应的3.4%±0.7%,n=4),而IMI诱导产生较强反应(35.0%±6.8%,n=4),这是典型两阶段,而介离子杀虫剂为一阶段(图8)。

以研究triflumezopyrim(1)和相关9-H类似物相似的方法进一步调查了dicloromezotiaz(2)对烟碱乙酰胆碱受体的抑制作用。用乙酰胆碱(100 μM)处理神经元(10s)得到对照反应,然后灌流dicloromezotiaz(2) (0.1~10 nM)8~10 min,再在此杀虫剂存在的的情况下用乙酰胆碱处理。试验发现dicloromezotiaz(2)是乙酰胆碱诱导电流的高活性抑制剂,IC50为1.2 nM(图9)。应用相似的记录条件,得到triflumezopyrim、IMI和呋虫胺的IC50分别为0.6、35、>50 nM。当IMI和呋虫胺的IC50接近具有显著兴奋活性的浓度(100 nM)时,dicloromezotiaz和triflumezopyrim的IC50比使烟碱乙酰胆碱受体兴奋的浓度低数个量级。

注:乙酰胆碱短时间(10 s)处理诱导产生强的内向电流,然后产生与ouabain敏感Na+/K+运输有关的外向电流。Dicloromezotiaz (2,DMT)诱导产生烟碱乙酰胆碱受体拮抗剂甲基牛扁碱(MLA)可阻断的弱的内向电流。箭头表示应用乙酰胆碱,水平线表示dicloromezotiaz (2)和甲基牛扁碱的应用时期。

2.3 Triflumezopyrim(1)对抗IMI褐飞虱的活性

测定了介离子杀虫剂对田间收集的半翅目水稻害虫的防治效果。曾经IMI对褐飞虱和二点黑尾叶蝉有好的防治效果,LC90分别为0.5、0.1 mg/L(表2)。然而,在过去10年害虫已对IMI产生高抗。在2012-2013年在马来西亚田间研究站对田间收集的褐飞虱进行了27个单独试验,发现IMI即使在250 mg/L也难以达到>90%的防效。在相同时期,triflumezopyrim(1) 以2、0.4 mg/L分别防治抗IMI的褐飞虱和二点黑尾叶蝉,防效一直维持在>90%。这清楚地表明田间出现了抗IMI的种群,以及triflumezopyrim(1)能成功地防治田间收集的高抗品系。

注:左边线为乙酰胆碱对照(100 μM,10 s),右边线为杀虫剂(10 μM,120 s)。

注:在灌流杀虫剂(8~10 min)前和后用乙酰胆碱(100 μM,10 s)刺激神经元。线性回归分析得到IC50为1.2 nM。

在2012-2015年,进一步进行室内研究比较了IMI和triflumezopyrim(1)对从中国田间收集的褐飞虱种群的防效。IMI的LD50(31~348 mg/L)比以前不同的研究者报道的对实验室褐飞虱敏感品系的0.08和0.61高很多。此外,IMI对不同地区田间褐飞虱的LD50变化很大,这可能说明抗性水平不同。相比,triflumezopyrim(1)的LD50小(0.94~1.32 mg/L),且不同区域间变化很小。这些结果表明在中国缺乏triflumezopyrim (1)抗性。此外,也表明triflumezopyrim(1)和IMI间不存在交互抗性。

2.4 triflumezopyrim(1)和dicloromezotiaz(2)的物理特性

表3列出了triflumezopyrim(1)和dicloromezotiaz(2)的物理特性,两者的Log分别为1.2和3.7。由于dicloromezotiaz(2)的log大,可预测其在植物维管系统中的移动性很差,刺吸式害虫较难获得。这与dicloromezotiaz(2)在生测试验中(membrane feeding assay)对桃蚜高活性,但在取食植物的杀虫剂生测试验中对半翅目昆虫活性弱相一致(表2)。

表3 triflumezopyrim(1)和dicloromezotiaz(2)的物理特性

3 总 结

最初以弱活性的介离子化合物3为先导物,经优化合成了一系列高活性的杀虫剂。优化最终得到了2个优秀的杀虫剂:防治飞虱的triflumezopyrim(1)和防治鳞翅目害虫的dicloromezotiaz(2)。这标志介离子化合物首次开发用于作物保护。

杀虫剂抗性行动委员会根据杀虫剂在靶标蛋白的结合位点将杀虫剂作用机制进行分类。Group 4为结合于烟碱乙酰胆碱受体正构位点的杀虫剂。根据与化合物化学型有关的代谢交互抗性风险的降低情况,把此类分成了不同的亚类。考虑到其与新烟碱类、亚砜亚胺类和丁烯酸内酯类化学型的不同,以及飞虱对triflumezopyrim(1)与以上类杀虫剂缺乏交互抗性(代谢型)地情况,triflumezopyrim(1)被分为新的亚类,4E。

发现triflumezopyrim(1)和dicloromezotiaz(2)对昆虫烟碱乙酰胆碱受体具有独特的生理作用。与其他IRAC Group 4具有强的激动活性的杀虫剂不同,介离子杀虫剂对烟碱乙酰胆碱受体功能有强的抑制作用,而对受体的激活作用非常弱。Cordova等人研究表明triflumezopyrim(1)处理的昆虫呈现不活跃中毒症状,而不是其他Group 4杀虫剂的兴奋症状。

Cordova等人介绍的9-H氯噻唑甲基类似物CPD1和CPD2产生抑制神经功能的中毒症状,与triflumezopyrim(1)的相似。中枢神经系统活性的降低与对烟碱乙酰胆碱受体强的抑制作用和对此受体弱的激活作用相一致。因此,令人惊奇的是发现蜚蠊被注射dicloromezotiaz(2)或CPD1和CPD2的9-甲基同系物出现神经兴奋症状。Dicloromezotiaz(2)和triflumezopyrim(1)具有较弱的激发烟碱乙酰胆碱受体介导的电流活性,而dicloromezotiaz(2)的抑制活性稍低于triflumezopyrim(1)(1.2︰0.6 nM)。

到目前仍不清楚为何1个小基团的取代大大地改变了化合物的活性。可能的原因是其活性依赖于对外围和中枢神经系统烟碱乙酰胆碱受体的激活和抑制的积累效应。9-H介离子类似物总的抑制作用可能高于其激活效应,而9-甲基类似物可能恰好相反。本文主要研究了昆虫的胸神经元,这可能不能充分反应外围神经系统的烟碱乙酰胆碱受体的活性。Salgado和Saar的发现表明作用于敏感性烟碱乙酰胆碱受体(nAChN)是正构位点激动剂产生神经兴奋作用的原因,因为在其在血淋巴中的水平达到兴奋浓度之前,去敏感性烟碱乙酰胆碱受体(nAChD)可能被彻底抑制。本文只研究了介离子杀虫剂分别对烟碱乙酰胆碱受体的作用,分别对nAChN和nAChD的影响还需要进一步研究。

Tan等人假设烟碱乙酰胆碱受体介导的电流激活程度是决定新烟碱类杀虫剂是具有兴奋性还是镇静性症状的因素。在Tan的研究中,部分激动剂如IMI、噻虫啉和啶虫脒引发兴奋症状,而呋虫胺、噻虫胺和烯啶虫胺等呈现相似于乙酰胆碱的完全或几近完全的激动性,诱导产生镇静中毒症状。然而,本研究发现呋虫胺和噻虫胺都诱导神经兴奋而不是Tan等人报道的镇静症状。考虑到triflumezopyrim(1)和dicloromezotiaz(2)都具有非常弱的激动活性(小于乙酰胆碱反应峰值的10%),然而它们的症状显著不同,所以不能简单根据兴奋活性程度来预测中毒症状。

Triflumezopyrim(1)对敏感和抗性飞虱种群都有优异的防效,研究已表明在亚洲不同地区进行的田间试验中有效。介离子杀虫剂新颖的结构是对飞虱抗性品系具有优异防效的根本。Group 4杀虫剂已被广泛地商业化防控刺吸式害虫。啶虫脒和噻虫啉等新烟碱杀虫剂用于防治苹果小蜷蛾、柑桔潜叶蛾和梨小食心虫,一般它们较少用于防治鳞翅目害虫。Dicloromezotiaz (2)对鳞翅目害虫有优异的防效,因此,介离子可能是现有鳞翅目防治剂如双酰胺类和多杀菌素类的潜在轮用药剂。

根据triflumezopyrim(1)和dicloromezotiaz(2)的活性、独特的结构和不寻常的生理作用,二者可能是满足全球食品安全需求的新的害虫防治方法。

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2017.03.04

TQ453

A

1009-6485(2017)03-0022-09

王昌钊(1979—),男,山东枣庄人,高级工程师,硕士,从事进出口商品检验和检测工作。E-mail: wangcz@snciq.gov.cn。

2017-06-10。

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