3种金属全冠修复对犬牙龈细胞Bcl-2和Bax表达的影响

李骏 陈林 范芹 龚晓娇 杨成雪

3种金属全冠修复对犬牙龈细胞Bcl-2和Bax表达的影响

李骏 陈林 范芹 龚晓娇 杨成雪

目的检测钴铬合金、银钯合金及纯钛金属全冠修复后犬牙龈细胞中Bcl-2和Bax基因mRNA的表达，探讨3种材料全冠修复对细胞凋亡的影响。方法选取5只成年雄性实验犬，将每只犬的牙弓分为4个区，以每区的尖牙为实验对象，分别行钴铬合金（A组）、银钯合金（B组）及纯钛（C组）金属全冠修复，第4区为空白对照（D组）；分别于修复后1、2、3个月采集尖牙牙龈组织，用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测牙龈细胞中Bcl-2、Bax基因mRNA的表达并计算Bcl-2/Bax的比率。结果修复后3个月，A组Bcl-2/Bax的比率高于D组，差异有统计学意义（P＜0．05）；修复后2、3个月，B组Bcl-2/Bax的比率低于D组，差异有统计学意义（P＜0．05）；修复后1、2、3个月， C组Bcl-2/Bax的比率与D组相比，差异均无统计学意义（P＞0．05）。结论钴铬合金抑制牙龈细胞凋亡，银钯合金促进牙龈细胞凋亡，而纯钛对牙龈细胞的凋亡无明显影响。

金属全冠；B淋巴细胞瘤/白血病-2；Bcl-2相关蛋白X

作者单位：遵义医学院附属口腔医院种植科，贵州 遵义 563003

全冠是一种覆盖整个牙冠表面的修复体，可以用来修复牙齿的形态、功能及美观；可分为金属全冠和非金属全冠，近年来已广泛应用于临床。在口腔环境中，金属全冠容易发生腐蚀，释放出各种金属离子及其衍生物，从而对牙周组织的健康产生不良影响[1]。不同金属由于成分及金相不同，对牙周组织细胞的刺激存在较大差异。随着细胞和分子技术的发展，有学者开始从细胞凋亡的角度研究材料的生物相容性[2]。Bcl-2家族是目前研究较为深入的细胞凋亡调控基因家族[3]，其中B淋巴细胞瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia 2，Bcl-2）是Bcl-2家族中最具代表性的抑制凋亡基因，而Bcl-2相关蛋白X（Bcl-2associated X protein，Bax）则是Bcl-2家族中最具代表性的促进凋亡基因。Bcl-2与Bax在功能上互相抑制，Bcl-2与Bax的比率对细胞是否发生凋亡起重要作用[4]。钴铬合金、银钯合金和纯钛是目前临床常用的3种金属材料，本文旨在探讨3种材料全冠修复对牙龈细胞凋亡的影响；通过检测细胞中Bcl-2和Bax两种基因mRNA的表达，计算Bcl-2/Bax的比率，评估钴铬合金、银钯合金和纯钛的生物学性能。

1 材料和方法

1.1 实验动物分组

健康成年雄性实验犬5只（由遵义医学院动物实验中心提供），按部位记录法将每只犬的牙弓分为4个区，以每只犬的尖牙为实验对象，按区为单位随机分为A、B、C、D 4个组，A组行钴铬合金全冠修复，B组行银钯合金全冠修复，C组行纯钛金属全冠修复，D组作为空白对照，每个组共5颗牙。

1.2 建立全冠修复模型

1.2.1 犬齿龈上洁治、龈下刮治。

1.2.2 牙体预备 洁治4周后取犬牙列原始模型并制作个别托盘，然后按要求备牙：牙合面预备1.5 mm，轴面预备1.5 mm，肩台宽1.0 mm，颈缘位于龈下0.5 mm。

1.2.3 制取模型 送义齿加工中心制作全冠。

1.2.4 试戴、调牙合并粘固金属全冠。

1.3 样本采集与检测

1.3.1 牙龈细胞的采集和保存 将各实验牙的颊侧龈缘从近中至远中3等分，分别于修复后1、2、3个月在每个牙位的相应等分部位，由龈缘向根方切取宽1 mm、长2 mm的牙龈组织，放入冻存管，-180℃液氮罐保存。

1.3.2 采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）的方法检测Bcl-2和Bax基因mRNA的相对表达。

（1）引物设计合成：

（2）提取总RNA。

（3）逆转录合成cDNA。

（4）实时荧光定量PCR反应：①每个样本分别用待检测基因和内参基因引物扩增，每个反应重复3次，反应体系在ABI7900 qPCR仪上进行：95℃、2 min，94℃、20 s，65℃、20 s，72℃、30 s，40个循环；②用CT值（每个反应管内荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数）代表实时荧光定量PCR的结果，采用△△Ct法计算目的基因的相对表达量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件对数据进行分析处理，计量资料以（均数±标准差）表示，A、B、C三组分别与D组比较，采用单因素方差分析（one-way analysis of variance，one-way ANOVA）进行统计学处理，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RNA的质量检测

用紫外分光光度计检测总RNA的纯度，OD 260 nm/280 nm比值在1.8～2.0之间。总RNA电泳，从上往下分别为28S和18S条带，可以看出，28S和18S条带比较完整，说明纯度符合要求，见表1。

图1 RNA电泳图

2.2 全冠修复前后各组牙龈细胞中Bcl-2和Bax的表达及Bcl-2/Bax的比率

（1）修复后1个月，A、B、C组Bcl-2和Bax的表达及Bcl-2/Bax的比率，与D组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

（2）修复后2个月，B组Bax的表达与D组相比有所增加，Bcl-2/Bax的比率与D组相比有所降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；A、C组Bcl-2和Bax的表达及Bcl-2/Bax的比率和D组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

（3）修复后3个月，A组Bcl-2和Bax的表达及Bcl-2/Bax的比率与D组相比有所增加；B组Bcl-2和Bax的表达与D组相比有所增加，Bcl-2/Bax的比率与D组相比有所降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；C组Bcl-2和Bax的表达及Bcl-2/Bax的比率，与D组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

3 讨论

随着金属全冠修复广泛应用于临床，认识和防治全冠金属材料对牙周组织细胞的影响越来越受到学者的关注。传统的检测牙周组织健康状况的方法，主要是依赖一些临床参数，如探诊深度、牙龈指数等。这些参数只能描述牙周组织改变的结果，而不能反映牙周组织目前的活动状态和未来的活动。近年来，一些学者开始从细胞和分子的领域研究修复体材料对牙周组织的影响，以期更好的评估材料的生物学性能。

细胞凋亡是一种广泛存在的由特定基因编码的以细胞DNA降解为特征的无明显细胞溶解的细胞自杀过程。凋亡可以从形态、蛋白、基因等不同水平进行检测，具有良好的准确性和可重复性，可作为评价口腔材料生物学性能的新方法[5]。Pioletti[6]应用RTPCR法检测口腔种植材料对成骨细胞Bcl-2和Bax基因mRNA表达的影响，发现对Bcl-2和Bax表达的观察能够有效评估材料与细胞间的相互作用。Bcl-2和Bax分别是Bcl-2家族中最具有代表性的抑制凋亡和促进凋亡基因。Bcl-2是从淋巴瘤中分离出来的原癌基因[7]，Bcl-2基因编码相应的Bcl-2蛋白，Bcl-2蛋白能够抑制细胞凋亡，参与调控细胞增殖与凋亡的动态平衡，同细胞分化、成熟及肿瘤的发生密切相关。Bax为凋亡诱导因子[8]，Bax基因编码相应的Bax蛋白，当Bax蛋白形成同源二聚体时，可促进细胞凋亡[9]；当Bax蛋白与Bcl-2蛋白形成异源二聚体时，则抑制细胞凋亡。Siqueira等[10]研究凋亡抑制因子Hsp27在多形性腺瘤中高表达并伴有Bcl-2/Bax的比率升高，证实了Bcl-2/Bax的比率与细胞凋亡密切相关，是调控细胞凋亡的关键因素。

表1 修复后1个月牙龈细胞中Bcl-2、Bax的表达及Bcl-2/Bax的比率（±s，n=5）

表1 修复后1个月牙龈细胞中Bcl-2、Bax的表达及Bcl-2/Bax的比率（±s，n=5）

组别Bcl-2 Bax Bcl-2/BaxA组 1.050±0.216 1.149±0.328 0.991±0.170 B组 1.062±0.277 0.928±0.198 1.173±0.148 C组 1.116±0.326 0.936±0.196 1.191±0.171 D组 1.033±0.044 1.017±0.016 1.004±0.049

表2 修复后2个月牙龈细胞中Bcl-2、Bax的表达及Bcl-2/Bax的比率（±s，n=5）

表2 修复后2个月牙龈细胞中Bcl-2、Bax的表达及Bcl-2/Bax的比率（±s，n=5）

注：与D组相比，*P＜0.05

组别Bcl-2 Bax Bcl-2/BaxA组 1.242±0.254 1.305±0.283 0.957±0.310 B组 1.304±0.227 1.656±0.482* 0.722±0.237*C组 1.005±0.182 0.974±0.192 1.104±0.102 D组 1.026±0.014 1.047±0.043 1.010±0.038

表3 修复后3个月牙龈细胞中Bcl-2、Bax的表达及Bcl-2/Bax的比率（±s，n=5）

表3 修复后3个月牙龈细胞中Bcl-2、Bax的表达及Bcl-2/Bax的比率（±s，n=5）

注：与D组相比，*P＜0.05

组别Bcl-2 Bax Bcl-2/BaxA组 3.937±0.582* 1.978±0.085* 2.010±0.377*B组 2.095±0.438* 3.454±0.592* 0.623±0.252*C组 1.129±0.302 1.097±0.253 1.191±0.171 D组 1.066±0.071 1.046±0.040 1.101±0.099

本实验以犬为研究对象，按统一标准行金属全冠修复，避免了临床患者个体差异大、修复后回访率过低等问题。实验结果显示：银钯合金金属全冠修复后2个月，Bax基因mRNA的表达与对照组相比有所增加，Bcl-2/Bax的比率下降；修复后3个月，Bcl-2和Bax两种基因mRNA的表达与D组相比均有所增加，而Bcl-2/Bax的比率下降；提示银钯合金在口腔环境中会析出一定量的金属离子及其衍生物，这些产物具有一定的细胞毒性，可促进牙龈细胞的凋亡。钴铬合金金属全冠修复后3个月，Bcl-2和Bax两种基因mRNA的表达与D组相比均有所增加，而Bcl-2/Bax的比率升高；提示钴铬合金会抑制牙龈细胞的凋亡，可能的原因依然是析出的金属离子及其衍生物，对正常细胞的周期产生了影响，但其机制尚不能明确。纯钛金属全冠修复前及修复后第1、2、3个月，牙龈细胞中Bcl-2和Bax两种基因mRNA的表达与D组相比无明显改变，提示纯钛不会对牙龈细胞的凋亡产生明显影响；刘婷等[5]通过Western blot技术检测4种烤瓷合金浸提液培养72 h的人牙龈成纤维细胞中Bcl-2的蛋白表达强度，提示纯钛具有较好的生物相容性，其结果与本研究结果一致。本实验研究周期终止于全冠修复后3个月，由于各种合金在口腔环境中均会逐渐钝化，生成的钝化膜对材料起保护作用而使合金的腐蚀速度减慢；因此，三种金属材料对牙龈细胞凋亡的远期影响还有待进一步研究。

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Influence onBcl-2andBaxin Gingival Cells of the Dogs After Restored With Three Types of Full Metal Crown

LI Jun CHEN Lin FAN Qin GONG Xiaojiao YANG Chengxue Implant Department, Stomatological Hospital Affiliated to Zunyi Medical College,Zunyi Guizhou 563003, China

ObjectiveTo observe the expression ofBcl-2andBaxgene in gingival cells of the dogs after restored with cobalt-chrome alloy full crown and palladium-silver alloy full crown and pure titanium full crown.Investigate the effects of three materials on apoptosis of the gingival cells.Methods5 adult male dogs were chosen for the experiment, each dog’s dental arch was divided into 4 sections. Each of the fang of each area was restored with cobalt-chrome alloy crown, palladium-silver alloy crown and pure titanium crown respectively, the fourth area is for control group. To collect the gingival tissue of fangs in 1, 2 and 3 months after restoration.The level ofBcl-2and Bax gene expression were detected by RT-PCR.ResultsAfter 3 months restoration, the group A was superior to group D on theBcl-2/Baxratio with statistically significant difference(P<0.05). After 2 and 3 months restoration, the group B was inferior to group D on theBcl-2/Baxratio with statistically significant difference (P<0.05). After 1, 2 and 3 months restoration, the group C had no statistically significant difference with group D on theBcl-2/Baxration (P>0.05).ConclusionThe cobaltchromium alloy inhibits the apoptosis of gingival cells, the palladium-silver alloy promotes the apoptosis of gingival cells, while the pure titanium has no obvious effect on the apoptosis of gingival cells.

full metal crown;Bcl-2;Bax

R783

A

1674-9308（2017）21-0085-04

10．3969/j．issn．1674-9308．2017．21．043

遵义医学院2012年度硕士启动科研基金（ZYKQS-2）

陈林