大黄素甲醚8-O-β-吡喃葡萄糖苷对皮肤黑色素瘤A375细胞凋亡的影响及机制研究

李晖，李文静，马荣，曹建华，韩志武（1.青岛大学药学院药理学系，山东青岛6601；.青岛市第三人民医院药学部，山东青岛 66040；3.青岛大学附属医院药学部，山东青岛 66003）

大黄素甲醚8-O-β-吡喃葡萄糖苷对皮肤黑色素瘤A375细胞凋亡的影响及机制研究

李晖1，2＊，李文静2，马荣2，曹建华2，韩志武3#（1.青岛大学药学院药理学系，山东青岛266021；2.青岛市第三人民医院药学部，山东青岛 266040；3.青岛大学附属医院药学部，山东青岛 266003）

目的：研究天然产物大黄素甲醚8-O-β-吡喃葡萄糖苷（PG）对皮肤黑色素瘤A375细胞凋亡的影响及机制。方法：以0、10、20、50 μg/mL的PG作用于A375细胞24、48、72 h后，采用CCK-8法测定细胞的存活率；以0（对照）、20、50 μg/mL的PG作用于A375细胞48 h后，通过流式细胞仪以膜联蛋白Ⅴ/碘化丙啶（PI）双染法检测细胞凋亡率；免疫印迹法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）和多腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的蛋白表达以及细胞色素C在线粒体内外的蛋白表达；以0（对照）、5、10 μmol/L的PG作用于A375细胞48 h后，采用酶底物法测定细胞中Caspase-8、Caspase-9的活性。结果：PG能有效降低A375细胞的存活率；与对照比较，20、50 μg/mL的PG作用后细胞凋亡率明显升高（P＜0.01），细胞中Caspase-3、PARP及细胞基质中细胞色素C的蛋白表达均明显增强（P＜0.05或P＜0.01），线粒体中细胞色素C蛋白表达明显减弱（P＜0.05或P＜0.01）；5、10 μmol/L的PG作用后细胞中Caspase-9活性明显增强（P＜0.05或P＜0.01），Caspase-8活性无明显变化。结论：PG能抑制A375细胞活性、促进细胞凋亡；其是通过破坏线粒体膜电位、促进细胞色素C外流来发挥促凋亡作用的。

大黄素甲醚8-O-β-吡喃葡萄糖苷；皮肤黑色素瘤A375细胞；细胞凋亡；线粒体途径

黑色素瘤一般指恶性黑色素瘤，来源于黑素细胞，多由黑素细胞所形成的痣或黑素斑发生恶变而来。近30年来，黑色素瘤的患病率和致死率正以每年4.1%的速度呈现显著上升趋势，已成为近年来所有恶性肿瘤中发病率增长最快的恶性肿瘤[1-3]。黑色素瘤极易转移致死，属于最难有效治疗的肿瘤之一。鉴于已转移的晚期黑色素瘤致死率极高，且其治疗方案相对有限，因此寻找安全有效的新型治疗手段抑制黑色素瘤是治疗关键。中药抗肿瘤有着悠久的历史和丰富的临床经验，具有药理活性显著、毒副作用小、不良反应轻微等特点。现代药化药理分析发现，羊蹄根中主要含有大黄素、大黄素甲醚、大黄酚等蒽醌类成分[4-5]，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤及止血等生物活性，据此推测，羊蹄根中的抗肿瘤有效成分对黑色素瘤也可能具有抑制作用。而羊蹄根中主要抗肿瘤成分大黄素甲醚8-O-β-吡喃葡萄糖苷（PG），是近年来研究的热点，受到广泛的关注[6-9]。本研究拟以羊蹄根中有效抗肿瘤成分PG作用于黑色素瘤细胞，观察PG对黑色素瘤细胞凋亡的影响，以期为黑色素瘤的临床治疗提供更多的新思路和新方法。

1 材料

1.1 仪器

Allegra X-22型高速低温离心机（美国Beckman Coulter公司）；UV-4802型紫外分光光度计（上海旦鼎国际贸易有限公司）；Mini-PRTEANⅡ型垂直电泳仪（美国Bio-Rad公司）；Tecan Safire 2型多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）；DYY-Ⅲ8型电泳仪（北京六一仪器厂）；FACS Vantage型流式细胞仪（美国BD公司）；Leica DMI 4000 B型荧光倒置显微镜（德国Leica公司）；凝胶成像系统（法国Vilber Lourmat公司）。

1.2 药品与试剂

PG（批号：140701，纯度：≥98%）和二甲基亚砜（DMSO）均购自美国Sigma公司；小鼠抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、多腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）、细胞色素C单克隆抗体和10～170 kD彩色预染蛋白质分子量标准（Marker）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒（中国碧云天生物科技有限公司）；大鼠抗β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体（北京康为世纪生物科技有限公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）（美国Cell Signaling Technology公司）；Ac-IETD-AFC（Caspase-8荧光底物）、Ac-LEHDAFC（Caspase-9荧光底物）（天津百萤生物科技有限公司）；RIPI细胞裂解液（北京索莱宝科技有限公司）；细胞膜联蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）-碘化丙啶（PI）凋亡检测试剂盒（中国BioTeke试剂有限公司）；胎牛血清（天津灏洋生物制品科技公司）；DMEM培养基（美国Invitrogen公司）。

1.3 细胞

人恶性黑色素瘤A375细胞株购自美国ATCC公司，用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基在37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。

2 方法

2.1 PG对A375细胞活性的影响

将A375细胞以5×105mL－1接种于96孔板中，于培养箱中培养至对数生长期，以0（对照）、10、20、50 μg/mL的PG（以DMSO配制，下同）孵育细胞，调节细胞密度为1×106mL－1，孵育24、48、72 h。然后向每孔加入10 μL CCK-8溶液，再将96孔板放入细胞培养箱孵育3 h，用酶标仪检测450 nm波长处的光密度（OD），计算细胞存活率，试验重复3次。细胞存活率（%）＝（加药孔OD值－空白孔OD值）/（对照孔OD值－空白孔OD值）×100%。

2.2 PG对A375细胞凋亡的影响

将细胞以5×105mL－1接种于6孔板中，于培养箱中培养至对数生长期，用0（对照）、20、50 μg/mL的PG孵育细胞48 h，调节细胞密度为1×106mL－1，加入5 μL AnnexinⅤ-异硫氰酸荧光素（FITC）的结合缓冲液，37℃温育30 min。然后在4℃下PI染色15 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，试验重复3次。在FACS管上样检测荧光强度，设激发波长488 nm、发射波长635 nm、变异系数（CV值）＜2%、前向角散射光（FSC）/侧向角散射光（SSC）设门。收集门内10 000个细胞，用Modfit LT 3.2软件分析凋亡率，以AnnexinⅤ－/PI－为活细胞、AnnexinⅤ+/PI－为凋亡早期细胞、AnnexinⅤ+/PI+为凋亡晚期细胞（死亡细胞）。

2.3 PG对A375细胞中Caspase-3、PARP及细胞色素C蛋白表达的影响

按“2.2”项下方法培养和孵育A375细胞48 h后收集细胞，用RIPA裂解液裂解细胞，收集裂解上清，采用BCA法测定蛋白浓度后，加入5×上样缓冲液（Loading buffer）煮沸后按Western blot法检测细胞中Caspase-3、PARP、细胞色素C（线粒体中和细胞基质中）及内参（β-actin）蛋白表达水平，试验重复3次。蛋白表达以目的蛋白/内参蛋白进行评价。将提取的蛋白样品混匀后上样于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，同时以Marker作为分子量标记，75 V恒压30～45 min，待样品进入分离胶后调电压至120 V。待目的蛋白分离后，进行转膜，250 mA恒流，湿转法转印1 h，以使目的蛋白转印到PVDF膜上。转印结束后，PVDF膜用5%脱脂牛奶室温摇床封闭1 h，之后用5%脱脂牛奶配制的一抗（β-actin按1∶3 000配制，Caspase-3、PARP、细胞色素C按1∶1 000配制）室温摇床孵育4 h。1×TBST缓冲液洗膜，后加入1×TBST缓冲液配制的二抗（HRP标记兔抗小鼠IgG按1∶3 000配制）孵育1 h，1×TBST缓冲液洗膜。在暗室内进行显影，采用凝胶分析软件Image J进行灰度分析。

2.4 PG对A375细胞中Caspase-8和Caspase-9活性的影响

按“2.2”项下方法培养A375细胞至对数生长期，用0（对照）、5、10 μmol/L的PG孵育A375细胞48 h，调节细胞密度为1×106mL－1。将每个浓度的蛋白均分为二份，分别加入Ac-IETD-AFC、Ac-LEHD-AFC，混匀后在37℃孵育2 h。通过酶标仪于发射波长505 nm、激发波长400 nm处检测荧光强度，试验重复3次。

2.5 统计学方法

采用Graph-pad Prism 5.01软件处理数据，计量资料以±s表示，采用t检验进行组间比较。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 PG能够抑制A375细胞活性

在PG孵育24 h后，仅50 μg/mL的PG能够明显降低A375细胞的细胞存活率（P＜0.05）；孵育48、72 h后，20、50 μg/mL的PG均能够明显降低A375细胞的细胞存活率（P＜0.05），综合考察可优先选择短时间48 h进行后续研究。此结果提示，PG能够抑制A375细胞活性，具有抗A375细胞潜质。PG对A375细胞存活率的影响见图1。

3.2 PG能够促进A375细胞凋亡

与对照比较，20、50 μg/mL的PG孵育后A375细胞凋亡率明显增加（P＜0.01），且随着PG剂量增加细胞凋亡率增加越明显。PG作用后A375细胞的流式图见图2，测定结果见图3。

图1 PG对A375细胞存活率的影响Fig 1 Effect of PG on survival rate ofA375 cells

图3 PG对A375细胞凋亡率的影响Fig 3 Effect of PG on apoptosis rate ofA375 cells

3.3 PG能够促进A375细胞中Caspase-3、PARP蛋白表达

与对照比较，20、50 μg/mL的PG孵育后A375细胞中Caspase-3、PARP蛋白表达均明显增强（P＜0.01），且随着PG浓度增加增强越明显。PG作用后A375细胞中Caspase-3、PARP表达的电泳图见图4，测定结果见图5。

3.4 PG通过线粒体途径启动凋亡

与对照比较，5、10 μmol/L的PG作用后A375细胞中Caspase-8活性无明显变化，而Caspase-9活性随着PG浓度的增加不断增强（P＜0.05或P＜0.01）。PG对A375细胞中Caspase-8、Caspase-9活性的影响见图6。

图4 PG作用后A375细胞中Caspase-3、PARP蛋白表达的电泳图Fig 4 Electrophoresis chart of the protein expressions of Caspase-3，PARP in A375 cells after treated by PG

图5 PG对A375细胞中Caspase-3、PARP蛋白表达的影响Fig 5 Effects of PG on the protein expressions of Caspase-3，PARPinA375 cells

图6 PG对A375细胞中Caspase-8、Caspase-9活性的影响Fig 6 Effects of PG on the activities of Caspase-8，Caspase-9 inA375 cells

3.5 PG通过降低线粒体中细胞色素C蛋白表达增强细胞基质中细胞色素C蛋白表达

与对照比较，20、50 μg/mL的PG作用后，A375细胞线粒体中细胞色素C蛋白表达明显降低（P＜0.05或P＜0.01），且随着PG浓度的增加降低越明显；A375细胞基质中细胞色素C蛋白表达明显增强（P＜0.05或P＜0.01），且随着PG浓度的增加增强越明显。PG作用后A375细胞中细胞色素C蛋白表达的电泳图见图7，测定结果见图8。

4 讨论

图7 PG作用后A375细胞中细胞色素C蛋白表达的电泳图Fig 7 Electrophoresis chart of the protein expression of cytochrome C in A375 cells after treated by PG

图8 PG对A375细胞中细胞色素C蛋白表达的影响Fig 8 Effect of PG on the protein expression of cytochrome C inA375 cells

PG是传统中药羊蹄根中的主要活性成分，也存在于大黄、何首乌、虎杖等中药中，是自然界中天然存在的蒽醌类化合物。自20世纪初，PG被提取、纯化并确认结构之后，诸多学者致力于其药理学功效的深入研究，近年来越来越多的研究结果见于报道，尤其PG抗肿瘤作用的研究成为关注的焦点[10-11]。研究报道提示，PG具有广谱抗肿瘤作用，对肺癌、口腔上皮癌、骨肉瘤、乳腺癌等多种肿瘤均具有凋亡诱导和转移侵袭抑制等作用，其抗肿瘤作用一部分是通过线粒体途径促凋亡实现的[12-13]。

针对黑色素瘤，截至目前，尚无PG抗黑色素瘤的相关报道。笔者推测PG可以应用到黑色素瘤的预防与治疗中，因此本研究以PG处理黑色素瘤A375细胞，检测PG对A375细胞增殖、凋亡的作用。结果显示，PG能够抑制A375细胞活性，促进细胞凋亡，促进细胞中Caspase-3和PARP的蛋白表达。

笔者对PG促凋亡作用机制进行了研究。通常细胞凋亡会通过线粒体途径、死亡受体途径两种主要方式，线粒体途径凋亡以线粒体膜电位受损、Caspase-9激活为特征，而死亡受体途径以死亡信号复合物（DISC）形成、Caspase-8激活为特征，二者均最终激活Caspase-3，启动凋亡不可逆转模式。本研究结果提示，PG的促凋亡作用可能是通过线粒体途径实现的，与死亡受体途径无关。

细胞色素C为生物氧化过程中的电子传递体，在线粒体上与其他氧化酶排列成呼吸链，参与细胞呼吸过程。通常情况下，细胞色素C主要存在于线粒体中，不能进入细胞基质；而在线粒体膜电位损伤后，由于膜通透性增加，细胞色素C进入细胞基质。因此，笔者以Western blot法对细胞基质和线粒体中细胞色素C的蛋白表达进行了检测。结果显示，细胞基质中细胞色素C蛋白表达增加，表明PG破坏了A375细胞中的线粒体膜电位，使线粒体膜通透性增加，细胞色素C进入细胞基质，加剧了细胞凋亡。

综上所述，PG能抑制A375细胞活性、促进细胞凋亡，其是通过破坏线粒体膜电位、促进细胞色素C外流来发挥促凋亡作用的。

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（编辑：邹丽娟）

Study on the Effect and Mechanism of Physcion 8-O-β-glucopyranoside on the Apoptosis of Skin Melanoma A375 Cells

LI Hui1，2，LI Wenjing2，MA Rong2，CAO Jianhua2，HAN Zhiwu3（1.Dept.of Pharmacology，School of Pharmacy，Qingdao University，Shandong Qingdao 266021，China；2.Dept.Pharmacy，Qingdao Third People’s Hospital，Shandong Qingdao 266040，China；3.Dept.of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Qingdao University，Shandong Qingdao 266003，China）

OBJECTIVE：To study the effect and mechanism of physcion 8-O-β-glucopyranoside（PG）on the apoptosis of skin melanoma A375 cells.METHODS：After A375 cells were treated by PG with 0，10，20，50 μg/mL for 24，48，72 h，CCK-8 method was adopted to determine the survival rate of cells.After A375 cells were treated by PG with 0（control），20，50 μg/mL for 48 h，flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of cells with membrane protein Ⅴ/propidium iodide（PI）double staining.Immunoblotting was used to detect the protein expressions of Caspase-3 and polyadenyl adenine diphosphate ribose polymerase（PARP）and protein expressions of cytochrome C inside and outside mitochondria.After A375 cells were treated by PG with 0（control），5，10 μmol/L for 48 h，enzyme substrate method was used to determine the activities of Caspase-8 and Caspase-9.RESULTS：PG can effectively decrease the survival rate of A375 cells.Compared with control，apoptosis rate of cells was obviously increased after treated by PG with 20，50 μg/mL（P＜0.01）；protein expressions of Caspase-3，PARP in cells and cytochrome C in cell matrix were obviously enhanced（P＜0.05 or P＜0.01）；and protein expression of cytochrome C in mitochondria was obviously weakened（P＜0.05 or P＜0.01）.Caspase-9 activity in cells was obviously enhanced after treated by PG with 5，10 μmol/L（P＜0.05 or P＜0.01）；and Caspase-8 activity had no obvious changes.CONCLUSIONS：PG can inhibit activity of A375 cells and promote its apoptosis，and its pro-apoptotic effects is achieved by destructing mitochondrial membrane potential and promoting cytochrome C outflow.

Physcion 8-O-β-glucopyranoside；Skin melanoma A375 cells；Cell apoptosis；Mitochondrial pathway

R965

A

1001-0408（2017）28-3941-05

2017-04-17

2017-08-16）

＊主管药师，硕士。研究方向：临床药学。电话：0532-89076099。E-mail：lihui821127@163.com

#通信作者：主任药师，硕士。研究方向：临床药学、药事管理。电话：0532-82911848。E-mail：zhiwu1218@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.15