光裸方格星虫纤溶酶SNFE的抗凝作用及机制研究Δ

李映新，黄晓亮，黄媛恒，班建东，庞丽君，黎钦蓉，雷丹青#（.广西医科大学药学院，南宁500；.广西医科大学基础医学院，南宁 500；.广西蛇毒研究所，南宁 500；.广西医科大学全科医学院，南宁500）

光裸方格星虫纤溶酶SNFE的抗凝作用及机制研究Δ

李映新1＊，黄晓亮1，黄媛恒2，班建东3，庞丽君1，黎钦蓉4，雷丹青3#（1.广西医科大学药学院，南宁530021；2.广西医科大学基础医学院，南宁 530021；3.广西蛇毒研究所，南宁 530021；4.广西医科大学全科医学院，南宁530021）

目的：研究光裸方格星虫纤溶酶SNFE的抗凝作用及机制，为SNFE的进一步开发利用提供参考。方法：将40只小鼠随机分为空白对照组（生理盐水）、血栓通组（阳性对照，15 mg/kg）和SNFE低、高剂量组（15、30 mg/kg），每组10只，尾iv给药后分别测定断尾出血时间（BT）和凝血时间（CT），以考察SNFE的抗凝作用。大鼠腹主动脉取血后，将试验分为空白对照组、阳性对照组和SNFE低、中、高质量浓度组（0.25、0.50、1.00 mg/mL），分别测定体外血浆的凝血酶原时间（PT）和复钙时间（PRT）（以尿激酶为阳性药物，10万U/mL）及二磷酸腺苷（ADP）诱导剂作用下的血小板5 min内的最大聚集率（PAG）（以阿司匹林为阳性药物，0.50 mg/mL），以分析SNFE的抗凝作用机制。结果：与空白对照组比较，各给药组小鼠的BT、CT均延长，其中血栓通组和SNFE高剂量组差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；阳性对照组和SNFE中、高浓度组大鼠血浆PT及各给药组大鼠血浆PRT均显著延长（P＜0.05或P＜0.01）；各给药组大鼠PAG均显著降低（P＜0.01）。结论：光裸方格星虫纤溶酶SNFE可能通过抑制内、外源性凝血因子的活性及ADP诱导的血小板聚集而发挥抗凝作用。

光裸方格星虫；纤溶酶；抗凝作用；血小板聚集

光裸方格星虫（Sipunculus Nudus）俗称“沙虫”“沙肠子”，隶属星虫动物门、星虫纲、方格星虫属，为暖水性世界广布种，营穴居生活，多栖息于河口、港湾及地表径流较丰富的沙质或沙泥质滩涂。方格星虫虫体肉质鲜美，富含蛋白质、氨基酸、多糖等多种活性物质，具有增强免疫力、抗疲劳、延缓衰老、滋阴降火及清肺化痰等功效，被称为“海洋冬虫夏草”[1-4]。当前，从海洋天然产物中开发药物是研究热点。本课题组前期从光裸方格星虫内脏匀浆液中提取到分子量约为32 000 D的纤维蛋白溶解酶——SNFE[5]，该提取方法已获一项国家发明专利（No.201010210919.5）。前期研究发现，SNFE在体外不仅具有激酶的活性，还能直接溶解纤维蛋白原和纤维蛋白；对血凝块具有良好的溶栓作用，且无出血活性和溶血作用[6]，这提示其具有开发为溶栓、抗栓药物的可能性。本研究通过考察SNFE对小鼠断尾后出血时间（BT）、凝血时间（CT）和血浆凝血酶原时间（PT）、复钙时间（PRT）等指标的影响研究其抗凝作用，并通过考察SNFE对血小板聚集率的影响对其抗凝机制进行初步探讨，为SNFE的进一步研究和开发提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

ME204E电子分析天平（德国梅特勒-托利多有限公司）；全血血小板聚集仪（美国Chrono-Log公司）；DEAE Sepharose CL-6B、Sephadex G-75柱（美国Pharmacia生物技术公司）。

1.2 药品与试剂

新鲜光裸方格星虫内脏，收集于广西钦州沿海；注射用尿激酶（UK，广东丽珠集团生物化学制药有限公司，批号：140609，规格：10 000 U/瓶）；注射用血栓通（广西梧州制药集团股份有限公司，批号：14091001，规格：150 mg/瓶）；阿司匹林肠溶片（亚宝药业太原制药有限公司，批号：15121，规格：25 mg/片）；PT测定试剂盒（上海太阳生物技术有限公司，批号：105259）；其余试剂均为国产分析纯。

1.3 动物

SPF级KM小鼠，体质量20～30 g，♀♂各半；SPF级SD大鼠，体质量250～350 g，♀♂不限。所有动物均购自广西医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（桂）2014-0002。

2 方法

2.1 SNFE的分离纯化

采用纤维蛋白平板法测定纤溶活性，以有溶圈出现的组分为活性组分。取新鲜方格星虫内脏，以3倍体积磷酸盐缓冲液（PBS，0.02 mol/L，pH 7.5，下同）在4℃条件下匀浆抽提，得粗酶液。粗酶液加入固体硫酸铵使饱和度达到50%，以沉淀活性蛋白。将收集的活性蛋白2 g溶于15 mL PBS中，以1 000×g离心10 min，取上清液上样于用PBS平衡的DEAE Sepharose CL-6B柱（50 cm×2.6 cm）上，用0～0.8 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为0.5 mL/min，分别测定各洗脱组分的纤溶活性。将收集的活性组分经透析浓缩后，上样于用PBS平衡的Sephadex G-75柱（100 cm×2.6 cm）上，用同一缓冲液洗脱，流速为0.5 mL/min，收集活性组分即为SNFE，经透析、冻干后，干粉存于－20℃冰箱中保存，备用。使用时，用生理盐水溶解至所需要的质量浓度[5]。

2.2 SNFE对小鼠BT的影响

将40只KM小鼠随机分为空白对照组、血栓通组（阳性对照）和SNFE低、高剂量组，每组10只。根据预实验结果，SNFE低、高剂量组小鼠分别尾iv给予15、30 mg/kg的SNFE溶液，空白对照组小鼠尾iv等体积生理盐水，血栓通组小鼠尾iv注射用血栓通15 mg/kg（生理盐水溶解），给药体积均为0.2 mL。给药0.5 h后，于距尾尖端0.3 cm处用剪刀截断鼠尾，使血液自行溢出。自截断鼠尾时即刻开始记时，每隔30 s用纸巾轻轻吸取血滴，直到纸巾无血的时间，即为BT。

2.3 SNFE对小鼠CT的影响

取小鼠同“2.2”项下分组、给药。给药1 h后，用内径为1 mm、长为10 cm的毛细管插入小鼠眼眶后静脉丛，至毛细管内血柱超过10 cm时取出，平放于桌面，每隔30 s折断毛细管一小段，观察有无血凝丝出现，记录从取血到出现血凝丝的时间，即为CT。

2.4 SNFE对大鼠血浆PT的影响

SD大鼠以10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）ip麻醉后，采用枸橼酸钠抗凝的采血管（1∶9）进行腹主动脉取血，将血液以1 000×g离心15 min，取上层血浆，备用。按照PT测定试剂盒说明，将50 μL低、中、高质量浓度（0.25、0.50、1.00 mg/mL）的SNFE溶液置于EP管中，加入50 μL血浆混匀并于37℃水浴孵育，记为SNFE低、中、高质量浓度组；以等体积的生理盐水代替药物加入，记为空白对照组；以等体积的尿激酶溶液（10万U/mL）代替药物加入，记为阳性对照组。每组设定5管平行对照，孵育3 min后，立即加入37℃预温的PT试剂0.2 mL，自加入时即刻开始计时。混匀后，每隔2 s以钢丝挑动，直到生成固体细丝的时间，即为PT。

2.5 SNFE对大鼠血浆PRT的影响

取血方法同“2.3”项下。将血液以200×g离心10 min，取上层血浆[即为富血小板血浆（PRP）]。然后按“2.4”项下方法进行分组、给药和孵育。孵育1 min后，各组分别加入0.025 mol/L的CaCl2溶液50 μL，自加入起即刻开始计时，混匀后每隔10 s以钢丝挑动，直到生成固体细丝的时间，即为血浆PRT。

2.6 SNFE对大鼠血小板聚集的影响

2.6.1 血小板悬液的制备 大鼠ip 10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉后，采用枸橼酸钠抗凝的采血管进行腹主动脉取血。将血液以200×g离心10 min，取上层血浆即为PRP。余下的血浆再以1 000×g离心10 min，再取上层液，即为贫血小板血浆（PPP）。2.6.2 血小板聚集率的测定 在测试杯中加入搅拌珠、10 μL质量浓度分别为0.25、0.50、1.00 mg/L 的SNFE溶液及280 μL的PRP，记为SNFE低、中、高质量浓度组；以等体积的阿司匹林溶液（0.50 mg/mL）代替SNFE加入，记为阳性对照组；以等体积的生理盐水代替SNFE加入，记为空白对照组。孵育3 min后，放入测试通道，加10 μL的二磷酸腺苷（ADP）至终浓度为5 μmol/L，用PPP（加入与相应测量管等质量浓度的药液10 μL，以消除药物自身颜色影响）调零，用血小板聚集仪测定空白对照管和给药管血小板5 min内的最大聚集率（PAG，%），每个浓度设5管平行对照。并按下述公式计算药物对血小板聚集的抑制率（AIP），AIP（%）＝（空白对照组的PAG－给药组的PAG）/空白对照组的PAG×100%。以AIP取自然对数值作为纵坐标、不同给药浓度的自然对数值为横坐标进行线性回归，根据回归方程计算半数有效剂量（ED50）。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 SNFE对小鼠BT、CT的影响结果

SNFE能延长小鼠的BT、CT，且随着剂量的增加效果越明显，其中血栓通组、SNFE高剂量组与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），结果详见表1。

表1 各组小鼠BT、CT的测定结果（±s，n＝10，s）Tab 1 Determination results of BT，CT in mice in each group（±s，n＝10，s）

表1 各组小鼠BT、CT的测定结果（±s，n＝10，s）Tab 1 Determination results of BT，CT in mice in each group（±s，n＝10，s）

注：与空白对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别空白对照组血栓通组SNFE低剂量组SNFE高剂量组CT 55.71±20.70 132.86±29.28＊＊68.57±14.64 90.00±18.97＊剂量，mg/kg 15 15 30 BT 232.50±28.72 402.00±80.44＊＊255.00±31.46 330.00±64.81＊

3.2 SNFE对大鼠血浆PT、PRT的影响结果

SNFE能延长大鼠血浆PT、PRT，且具有明显的浓度依赖性。其中阳性对照组和SNFE中、高质量浓度组大鼠血浆PT与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），各给药组大鼠血浆PRT与空白对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.01），结果详见表2。

表2 各组大鼠血浆PT、PRT的测定结果（±s，n＝5，s）Tab 2 Determination results of plasma PT，PRT in rats in each group（±s，n＝5，s）

表2 各组大鼠血浆PT、PRT的测定结果（±s，n＝5，s）Tab 2 Determination results of plasma PT，PRT in rats in each group（±s，n＝5，s）

注：与空白对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别空白对照组阳性对照组SNFE低质量浓度组SNFE中质量浓度组SNFE高质量浓度组PRT 77.40±8.05 242.68±22.01＊＊144.00±15.10＊＊445.00±36.97＊＊＞600＊＊剂量10 000 U/mL 0.25 mg/mL 0.50 mg/mL 1.00 mg/mL PT 14.78±1.72 21.78±0.99＊14.61±0.84 17.63±1.60＊35.02±3.08＊＊

3.3 SNFE对ADP诱导的大鼠血小板聚集的影响结果

SNFE对ADP诱导的大鼠血小板聚集有抑制作用，且具有明显的浓度依赖性。各给药组大鼠血小板5 min内的PAG与空白对照组比较均明显减小（P＜0.01），ED50为0.62 mg/mL，结果详见表3。

表3 各组大鼠血小板PAG、AIP的测定结果（±s，n＝3，%%）Tab 3 Determination results of PAG，AIP of platelet of rats in each group（±s，n＝3，%%）

表3 各组大鼠血小板PAG、AIP的测定结果（±s，n＝3，%%）Tab 3 Determination results of PAG，AIP of platelet of rats in each group（±s，n＝3，%%）

注：与空白对照组比较，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control group，＊＊P＜0.01

组别空白对照组阳性对照组SNFE低质量浓度组SNFE中质量浓度组SNFE高质量浓度组剂量，mg/mL AIP 81.10±4.2 31.90±10.1 46.38±7.4 62.50±4.4 0.50 0.25 0.50 1.00 PAG 58.0±2.9 11.0±2.4＊＊39.3±4.9＊＊30.5±4.5＊＊21.7±2.1＊＊

4 讨论

BT是指血液从开始流出到自然止血所需的时间，其长短主要与毛细血管功能、血小板的数量和功能、组织因子、组织收缩力以及纤溶酶等因素有关[7]。CT是指从血液离体至自然凝固所需的时间，其长短主要与凝血因子的激活和血液黏稠度等因素有关[8]。一般认为，药物的抗凝作用可以通过测定BT和CT来反映[9]。本课题组前期研究发现，SNFE具有良好的溶栓活性[6]。本研究进一步发现，SNFE可延长小鼠BT和CT，这提示其具有较好的抗凝作用。

PT和PRT被认为分别是反映外源性凝血和内源性凝血是否正常的敏感性指标。PT与外源性凝血因子活性有关，PRT与内源性凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅹ等的功能有关，两者可反映药物影响凝血过程的作用途径[10-11]。本研究结果发现，SNFE能延长大鼠血浆PT和PRT，这提示SNFE可以通过影响外源性凝血因子和内源性凝血因子的活性，从而影响外源性凝血和内源性凝血过程。

血小板的黏附聚集并形成血栓，以及释放ADP、5-羟色胺、前列腺素等与凝血有关的各种因子，是促进血液凝固的重要因素。ADP是机体释放的促进血小板聚集的最重要的物质，能够与血小板表面受体结合，激活血小板纤维蛋白原受体，从而引起血小板聚集，作为诱导血小板聚集的常用激活剂；同时，ADP也是其他诱导剂如凝血酶胶原、肾上腺素等激发血小板活性的一个必要的共同因子[12-13]。本研究结果发现，SNFE在体外能够抑制ADP诱导的血小板聚集，这可能是SNFE发挥抗凝作用的另一机制。

综上所述，SNFE具有较好的抗凝作用，其作用机制可能与降低内、外源性凝血因子的活性以及抑制ADP诱导的血小板聚集有关。

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Study on the Anti-coagulation Effect and Mechanism of Fibrinolytic Enzyme SNFE in Sipuculus Nudus

LI Yingxin1，HUANG Xiaoliang1，HUANG Yuanheng2，BAN Jiandong3，PANG Lijun1，LI Qinrong4，LEI Danqing3
（1.School of Pharmacy，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China；2.Basic Medical College，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China；3.Institute of Snake Venom Research，Nanning 530021，China；4.General Medical School，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China）

OBJECTIVE：To study the anti-coagulation effect and mechanism of fibrinolytic enzyme SNFE in sipuculus nudus，and provide reference for further development of SNFE.METHODS：40 mice were randomly divided into blank control group（normal saline），Xueshuantong group（positive control，15 mg/kg）and SNFE low-dose，high-dose group（15，30 mg/kg），10 in each group.After intravenous injection in tail，tail bleeding time（BT）and clotting time（CT）were respectively determined to investigate the anti-coagulation effect of SNFE.After taking blood in abdominal aorta of rats，test was divided into blank control group，positive control group and SNFE low-mass concentration，medium-mass concentration，high-mass concentration groups（0.25，0.50，1.00 mg/mL）.Prothrombin time（PT），re-calcium time（PRT）（using orokinase as positive drug，100 000 U/mL），and maxmum platelet aggregation rate（PAG）in 5 min under adenosine diphosphate（ADP）inducer（using asprin as positive drug，0.50 mg/mL）were respectively determined，and anti-coagulation effect mechanism of SNFE was analyzed.RESULTS：Compared with blank control group，BT，CT of mice in each group were prolonged，with statistical significance in Xueshuantong group and SNFE high-dose group（P＜0.05 or P＜0.01）.Plasma PT of rats in positive control group，SNFE medium-dose，high-dose groups and PRT in each administration group were significantly prolonged（P＜0.05 or P＜0.01）；and PAG in administration group was significantly reduced（P＜0.01）.CONCLUSIONS：The fibrinolytic enzyme SNFE in sipuculus nudus can play its anti-coagulant effect by inhibiting the activity of coagulation factors in internal and external sources and ADP-induced platelet aggregation.

Sipuculus nudus；Fibrinolytic enzyme；Anti-coagulation effect；Platelet aggregation

R285

A

1001-0408（2017）28-3938-04

2017-04-26

2017-07-12）
（编辑：林 静）

广西医科大学青年科学基金项目（No.GXMUYSF-2014025）；广西高校-广西再生医学重点实验室开放课题（No.桂再重开15-05）

＊高级实验师，博士。研究方向：生化药理。电话：0771-5358272。E-mail：marchimoro@yeah.net

#通信作者：研究员，硕士生导师。研究方向：生化药理。电话：0771-5358272。E-mail：506448694@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.14