蜂王浆对尾静脉注射4T1细胞小鼠抗氧化能力的影响

张 爽, 邵琪琪, 耿海洋, 苏松坤(.福建农林大学蜂学学院；2.福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002)

蜂王浆对尾静脉注射4T1细胞小鼠抗氧化能力的影响

张 爽1,2, 邵琪琪1, 耿海洋1, 苏松坤1
(1.福建农林大学蜂学学院；2.福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002)

探讨蜂王浆对尾静脉注射4T1细胞小鼠的抗氧化和免疫力的影响.将4T1细胞或其与蜂王浆的混合物通过尾静脉注射入小鼠体内，ELISA法检测蜂王浆对小鼠血清、肝脏和肾脏中与抗氧化能力相关的指标及血清中和免疫力相关细胞因子水平的影响.结果表明，和模型对照组相比，蜂王浆(50、100 mg·mL-1)可以显著提高小鼠血清内T-AOC、IFN-α(P<0.05)水平，降低IL-4的水平(P<0.05)；蜂王浆剂量为50 mg·mL-1时，IFN-γ的含量显著增加(P<0.05).蜂王浆(100 mg·mL-1)显著提高肾脏中T-AOC的水平(P<0.05).可见，蜂王浆可以改善尾静脉注射4T1细胞小鼠的抗氧化能力和免疫力.

蜂王浆; 4T1细胞; 免疫力; 抗氧化

Abstract: To explore the antioxidant and immune efficacy of royal jelly, mice were injected with 4T1 cells (control) or its mixture with royal jelly through vein in tail. ELISA method was used to detect indicators associated with antioxidant capacity in serum, liver and kidney, and serum cytokines related to immune system. The results showed that comparing with the control group, interleukin-4 (IL-4) level in royal jelly group decreased significantly (P<0.05) while interferon-α (IFN-α) level and total antioxidant capacity (T-AOC) notably surged (P<0.05). In addition, interferon-γ (IFN-γ) level significantly improved (P<0.05) when royal jelly was at the dose of 50 mg·mL-1, but T-AOC in kidney was notably improved only at the dose of 100 mg·mL-1(P<0.01). It is concluded that royal jelly improved the immunity and antioxidant capacity of mice injected with 4T1 cells though vein in tail.

Keywords: royal jelly; 4T1 cells; immunity; antioxidant capacity

蜂王浆是由哺育蜂咽下腺与上颚腺分泌的一种特殊乳浆状物质，用于饲喂蜂王及3日龄以内幼虫，药食同源.新鲜蜂王浆中含60%～70%的水分，3%～8%的脂类，10-HDA的含量不低于1.4%，9%～18%的蛋白，3%～13%果糖，4%～8%葡萄糖，还有微量元素、矿物质等[1].国内外的研究者对蜂王浆做了许多研究，发现蜂王浆具有多种药理活性，如抑菌、抗氧化、提高机体免疫力、抗癌等[2].

乳腺癌是最常见的一种恶性肿瘤，并随着病情的发展可转移到骨、肺、肝及脑等组织.移植瘤乳腺癌模型、乳腺癌细胞系及转基因工程小鼠常用于乳腺癌肺转移模型，而尾静脉、皮下和乳垫原位是移植瘤乳腺癌模型常用的接种部位.尾静脉注射4T1细胞，可以通过血行转移到远处，并形成转移灶.将MDA-MB-231人的乳腺癌细胞通过尾静脉注射入裸鼠内，通过活体内光学成像和荧光两种技术观察到，MDA-MB-231细胞随着静脉循环主要滞留在肺部，在肺部形成病灶并长大增多[3].Li et al[4]把人的脐带间充质基质细胞(UC-MSCs)通过尾静脉的方式注入到放射性脊髓病变的大鼠，Li et al[5]把小鼠乳腺癌4T1细胞也通过尾静脉的方式注入到小鼠体内建立肺转移模型.在BALB/c小鼠中，4T1细胞的生长与转移的情况与乳腺癌在人体中生长非常相似，是研究人Ⅳ期乳腺癌的合适动物模型[6].

而关于通过尾静脉注射蜂王浆与4T1细胞混合物，蜂王浆对小鼠的影响作用鲜有报道.本文将蜂王浆与4T1细胞的混合物通过尾静脉注射入小鼠，检测蜂王浆对小鼠血清、肝脏和肾脏中与抗氧化相关的指标和血清中与免疫力相关的细胞因子水平，为更好地开发利用蜂王浆提供理论基础.

1 材料

蜂王浆：浙江杭州，油菜浆；使用前保存于-20 ℃.

细胞株：小鼠乳腺癌细胞(4T1)，购自中国科学院上海生科院细胞资源中心，用含10%胎牛血清的1640培养液培养，置于37℃、5% CO2培养箱中培养.每天更换培养液，2天传代1次，试验所用的细胞均处于对数生长期，且存活细胞百分率均在95%以上(台盼蓝染色法).

动物：BALB/c纯系小鼠，雌性，4周龄，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪2012-0002).小鼠饲养于福建医科大学动物实验中心的SPF级动物房中，环境清洁、通风良好，自由饮食.适应1周后，开始灌胃.

2 方法

2.1 乳腺移植瘤模型的建立及实验动物分组

小鼠乳腺癌模型的建立：取对数期生长的4T1细胞，用0.25%胰蛋白酶消化2～3 min，培养液终止消化，1000 r·min-1低速离心3 min后去掉上清液，然后用PBS制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×105个·mL-1.无菌条件下，用l mL注射器将肿瘤细胞或与蜂王浆的混合液通过尾静脉注射入小鼠体内[7]，分为正常组，模型对照组，蜂王浆低、高剂量组，即50、100 mg·mL-1，每组8只.再继续饲养21天后，全部处死.

2.2 试验样本采集

2.2.1 血清的采集 末次给药后，禁食不禁水，24 h后，将各组小鼠摘眼球取血并分离血清.处死实体瘤小鼠以前，摘除小鼠右眼球，取血，血样置于1.5 mL离心管中，室温静置1 h，3 000 r·min-1离心10 min，小心吸取上层血清，避免红细胞吸入.分装，-80 ℃保存，以备后续检测.

2.2.2 组织的收集 取血后，处死小鼠，快速取出肝、肾、胸腺和脾脏组织并称重，肝和肾贮存于-80 ℃，检测其抗氧化能力.

2.3 蜂王浆对小鼠血清中细胞因子水平的测定

分别取各组鼠血清，按照相应ELISA试剂盒说明书测定血清中Th1细胞因子：IFN-r、IFN-a、IL-2及Th2细胞因子：IL-4、IL-10.

2.4 蜂王浆对小鼠血清抗氧化能力的影响

分别取各组小鼠血清，按照相应试剂盒说明书测定血清中总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量.

2.5 蜂王浆对小鼠肝、肾组织抗氧化能力的影响

取各组荷瘤裸鼠肝、肾组织，于冷的生理盐水中匀浆，离心，得10%组织匀浆液.按照相应试剂盒说明书检测SOD、T-AOC及谷胱甘肽还原酶(GR)的活性.

2.6 统计分析

利用spss 17.0软件中单因素方差分析方法的Turkey′s post hoc test对所得到的数据进行处理分析.结果表示为平均值±SD.

3 结果

3.1 蜂王浆对尾静脉注射小鼠脏器的影响

由表1可知，蜂王浆低、高剂量组小鼠的胸腺重量均比正常组显著增加(P<0.05)，蜂王浆低剂量组小鼠的胸腺重量与模型对照组无显著差异.蜂王浆低、高剂量组小鼠的脾重量与正常组的无显著差异，而比模型对照组显著降低(P<0.05).模型对照组，蜂王浆低、高剂量组的小鼠肝重量比正常组均显著增加(P<0.05)，但模型对照组小鼠的肝重量与蜂王浆低、高剂量组无显著差异.由此可见，对于尾静脉注射4T1细胞的小鼠，蜂王浆具有保护脾的作用，而对其他器官并无显著影响.

表1 蜂王浆对小鼠脏器重量的影响(胸腺、脾、肾、肝)1)Table 1 Effect of royal jelly on the organs weight(thymus, spleen, kidney and liver) of mice

1)n=8，与正常组比较，*表示P<0.05；与模型对照组比较，Δ表示P<0.05.

3.2 血清中细胞因子水平的检测

从表2可以看出，蜂王浆低、高剂量组小鼠血清中的IL-2、IL-10与模型对照组并无显著差异.蜂王浆低、高剂量组小鼠血清中IL-4的含量与和正常组无显著差异，但是比模型对照组显著降低(P<0.05).蜂王浆低、高剂量组小鼠血清中IFN-α的含量与正常组无显著差异，但是比模型对照组显著增加(P<0.05).蜂王浆低剂量组小鼠血清中IFN-γ的含量显著高于正常组(P<0.05)和模型对照组(P<0.05)，而高剂量组虽无显著差异，但也有增加的趋势.这使免疫调节的Th1/Th2比例增大，利于Th1，有利于小鼠免疫力的提高，增强抗肿瘤的能力.

表2 蜂王浆对小鼠血清中细胞因子的影响1)Table 2 Effect of royal jelly on the serum cytokine level of mice

1)n=8，与正常组比较，*表示P<0.05；与模型对照组比较，Δ表示P<0.05.

3.3 血清中抗氧化能力的检测

从表3可以看出，蜂王浆低、高剂量组小鼠血清中SOD、MDA的含量和模型对照组均无显著差异.蜂王浆低、高剂量组小鼠血清中T-AOC的含量比正常组(P<0.05)、模型对照组(P<0.05)均显著增加.这说明，蜂王浆和4T1细胞混合注射入小鼠，有利于提高小鼠的抗氧化能力.

表3 蜂王浆对小鼠血清中抗氧化相关指标的影响1)Table 3 Effect of royal jelly on the antioxidant of the serum in mice

1)n=8，与正常组比较，*表示P<0.05；与模型对照组比较，Δ表示P<0.05.

3.4 肝、肾中抗氧化能力的检测

由表4可知，蜂王浆低、高剂量组小鼠肝脏中的T-AOC、SOD及GR与模型对照组均无显著作用；仅蜂王浆高剂量组小鼠肾中的T-AOC比正常组(P<0.05)、模型对照组(P<0.05)显著增加，且SOD的含量与正常组无显著差异.这说明，蜂王浆有助于提高肾中T-AOC与SOD的水平.

4 讨论

提高机体免疫力是一种重要的抗癌机制，如增强巨噬细胞的吞噬能力，促进NK、LAK细胞的活性及对机体内T、B细胞的影响，使机体的体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫共同发挥抗肿瘤的作用[8].脾和胸腺是体液和细胞免疫的重要器官，但是免疫器官的重量并不是一个精确的免疫功能指标[9]，蜂王浆对免疫器官的作用需要进一步研究.宿主的免疫调节能够抑制肿瘤的生长，因此免疫治疗作为治疗癌症的辅助手段.抗肿瘤的免疫调节作用取决于T细胞[10].辅助性T细胞(Th细胞)，能分泌多种细胞因子.根据它们所分泌的细胞因子可分为4个亚型，即Th0、Th1、Th2、Th3.Th1细胞亚群主要分泌IL-2、IFN-r及TNF-β，它们可参与细胞免疫，介导细胞毒与局部炎症相关的免疫应答并可辅助抗体的生产，有较强的抗肿瘤活性，与抗血管生成相关.Th2细胞亚群刺激B细胞增殖并产生免疫球蛋白抗体，主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，这些细胞因子均可抑制机体抗肿瘤免疫应答的作用[8].所以当Th1型细胞占优势时，机体处于良好的抗肿瘤状态；当Th2型细胞占优势时，则利于肿瘤的发展.ver et al[11]用不同的方式给予CBA小鼠和Y59大鼠蜂王浆.通过测定免疫球蛋白、血小板细胞数、淋巴组织的重量等指标，蜂王浆具有免疫调节特性.OkamotoI et al[12]通过试验筛选出蜂王浆中抗过敏因子，即MRJP3，并发现它除了能抑制IL-4的产生外，还可提高免疫力，具有较高的抗原性，能够抑制免疫小鼠血清中anti-OVA-IgE和IgG的浓度的升高，表明MRJP3在体内外均有增强机体免疫力的功能.蜂王浆低、高剂量组小鼠血清中的IL-4水平显著比对照组中的降低，同时蜂王浆组的IFN-a水平比模型对照组显著增加，而仅蜂王浆低剂量组中的IFN-r比模型对照组显著增加，这说明小鼠的免疫力有益于Th1型细胞分泌因子的表达，即向抑制肿瘤生长的方向发展.

表4 蜂王浆对小鼠肝脏和肾中与抗氧化相关指标的影响1)Table 4 Effect of royal jelly on the antioxidant capacity of liver and kidney in mice

1)n=8，与正常组比较，*表示P<0.05；与模型对照组比较，Δ表示P<0.05.

许多具有抗氧化的食物，如白藜芦醇[13]、野生苦菜[14]、茶叶、姜黄、葡萄等都具有很好的抗肿瘤能力.对于氧自由基，细胞天然的防御系统是有抗氧化酶系统组成，包括SOD、谷胱甘肽S转移酶(GST)和非酶抗氧化系统如还原型谷胱甘肽(GSH)、抗坏血酸(vitamin C)和生育酚(vitamin E)[15].氧化应激对于肿瘤抑制基因的突变所诱导的乳腺癌病因有着重要的作用[16].抗氧化抗癌药物的使用，能够促进清除细胞内有害自由基的天然抗氧化分子的研究.女性通过饮食如黄酮类使身体获得一个好的抗氧化水平，可以降低机体的氧化应激水平，防止乳腺癌[15].已有很多关于蜂王浆抗氧化的研究，如：蜂王浆通过提高肝中的总抗氧化能力、过氧化氢酶、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶和碱性磷酸酶的含量，能够改善羟甲雄酮所诱导的肝损伤状况[17]；蜂王浆和维生素协同给予腹腔注射苯肼的小鼠，小鼠血清中T-AOC的水平显著提高，并改善精子的质量[18]；蜂王浆可以通过提高GSH、GST、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及SOD的水平，改善由环磷酰胺引起的氧化损伤及凋亡作用[19].抗氧化剂能够减小DNA受损的机率，即具有保护DNA的能力，因此抗氧化剂具有防止乳腺癌的作用[20].本研究中，蜂王浆组小鼠血清的SOD含量虽与模型对照组无显著差异，但是均比模型组高，这说明蜂王浆有提高血清中SOD的趋势.向紫杉酚诱导的睾丸损伤模型小鼠灌胃蜂王浆，发现蜂王浆低剂量组小鼠睾丸中MDA的含量与模型对照组无显著差异，而蜂王浆高、低剂量有显著差异，并且灌胃蜂王浆的正常小鼠睾丸中MDA含量与正常小鼠组和模型组都没有显著差异[21].因此，在本试验中，可能是因为蜂王浆的剂量不够大或者是因为给予蜂王浆的方式不同而产生的代谢物不同，从而使小鼠血清中MDA和SOD的水平与模型组无显著差异.蜂王浆组小鼠血清中的T-AOC水平显著提高.在肝肾组织中，仅蜂王浆高剂量组中肾的T-AOC水平显著提高，其他均无显著差异.这说明蜂王浆在一定程度上提高了此模型小鼠的抗氧化能力.并有研究者推测多酚类物质可能是赋予蜂王浆抗氧化的物质[22].

本文仅利用ELIAS的方法检测了血清、肝和肾中一些和抗氧化与免疫力相关的指标，但是蜂王浆如何作用于4T1细胞及在小鼠体内转移的机制，如各免疫因子基因的调控表达及其相互作用还不清楚.随着免疫学、分子生物学及测序技术的不断发展，蜂王浆必将会更好地服务于人类的健康事业.

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(责任编辑:吴显达)

Theantioxidanteffectofroyaljellyonmiceinjectedwith4T1cellsthroughveinintail

ZHANG Shuang1,2, SHAO Qiqi1, GENG Haiyang1, SU Songkun1
(1.College of Bee Science; 2.College of Life Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

R392.9; S87

A

1671-5470(2017)05-0557-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.05.013

2017-02-26

2017-04-29

现代农业产业技术体系建设专项资金资助(CARS-45-KXJ3).

张爽(1986-)，女，博士研究生.研究方向：蜂产品应用与加工.Email：zhsh_0925@163.com.通讯作者苏松坤(1970-)，男，研究员，博士生导师.研究方向：蜜蜂科学.Email：susongkun@zju.edu.cn.