芒果CDDP分子标记正交优化设计及引物筛选

2017-10-12黄国弟莫永龙郭丽梅广西壮族自治区亚热带作物研究所广西南宁530001

福建农林大学学报（自然科学版） 2017年5期

张宇, 黄国弟, 黄强, 莫永龙, 覃旭, 郭丽梅(广西壮族自治区亚热带作物研究所，广西南宁 530001)

张宇, 黄国弟, 黄强, 莫永龙, 覃旭, 郭丽梅
(广西壮族自治区亚热带作物研究所，广西南宁 530001)

以芒果基因组DNA为模板，选择正交设计试验对控制DNA保守序列多态性——聚合酶链式反应(CDDP-PCR)的4个因素(模板DNA浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Mg2+DNA聚合酶用量)进行正交试验，构建了较佳的芒果CDDP-PCR反应体系，含0.50 U Mg2+DNA聚合酶、0.40 mmol·L-1dNTPs、1.00 μmol·L-1引物、0.50 ng·μL-1模板DNA，加双蒸水使得总体积达20.00 μL.对比四因子对PCR反应的影响，影响最强的因素是含Mg2+的DNA聚合酶，影响最弱的因素是模板DNA.利用供试的20个芒果品种验证了该体系的稳定性和可行性，21条CDDP引物均可扩增出明晰整齐的条带.

芒果; CDDP; 反应体系; 引物筛选; 优化

Abstract: To optimize the conserved DNA sequence polymorphism polymerase chain reaction (CDDP-PCR) for mango, orthogonal experiment, including 4 factors of template DNA concentration, dNTPs concentration, primer concentration, Mg2+DNA polymeras at 4 levels was designed, with mango genome DNA as template. The optimized CDDP-PCR system contained 0.50 U Mg2+DNA polymerase, 0.40 mmol·L-1dNTPs, 1 mol·L-1primer template DNA and 0.50 ng·μL-1DNA template, with double distilled water added to a total volume of 20 μL. The results showed that Mg2+DNA polymerase played the most important role in the PCR reaction, with DNA being the weakest factor. All 21 primers produced clear and neat bands for 20 mango species with the optimized condition.

Keywords: mango； CDDP； reaction system； primers screening； optimization

芒果(MangiferaindicaL.)属于芒果属(MangiferaL.)漆树科(Anacardicaeae)常绿药食两用型经济树种.芒果果色丰富、果型多样，主要分布在南北回归线之间的亚热带、热带地区以及干热河谷地形区域，栽培历史超过1 500 a，中国为其主要的分布区域，是栽培芒果的发源地之一[1-2].在长期的栽培驯化中，受种子高度杂合、市场种苗流通杂乱等因素的制约，芒果品种一直存在同名异物、异物同名等现象，通过实生变异、人工杂交、辐射诱变等途径已培育出许多优质的芒果品种.然而，芒果存在高度异花授粉，这给亲本选择和品种区分带来严重阻碍[3-4].因此，研发芒果品种鉴别技术具有很好的应用价值.

单一遵从植物学性状鉴定芒果种质不能避免外界环境因素的影响，且鉴定时间较长，鉴定结果有偏差.采用分子标记技术可有效规避以上因素的干扰.谢江辉等[5]利用RAPD分析了39份芒果属种质的胚性特征；He et al[6]利用ISSR明确了23份芒果栽培种之间的亲缘关系；姚全胜等[7-8]应用SSR标记技术分别对11份芒果核心种质资源进行指纹图谱构建，对116份核心种质资源进行遗传分析；雷新涛等[9]对世界芒果主产区栽培的31个主流品种进行了AFLP分析，研究芒果种内的遗传关系.然而，这些传统上的随机DNA分子标记，往往得不到与目标性状基因相关联的标记位点，其品种鉴别效率相对较低.随着新的DNA标记技术的不断开发，SRAP[10-11]、TRAP[12]和SCoT[13]等新型目标分子标记技术也逐渐被应用于芒果种质资源的研究.

Collard et al[14]基于DNA保守序列特性，开发出CDDP(comserved DNA-derived polymorphism)分子标记.它是根据植物DNA中具有重要遗传信息表达功能的保守序列设计而来的单引物，且植物中DNA保守序列在不同物种间通用[15-18].在水稻(Oryzasativa)[14]、欧白英(Solanumdulcamara)[19]、菊花(Compositae)[20]、牡丹(Paeoniasuffruticosa)[21-22]、大豆(Soybean)[23]等植物材料上的应用研究表明，CDDP分子标记具有易操作、低费用、强多态等特点，可有效产生与目标性状有关的标记，是对RAPD、ISSR、TRAP、SCoT等随机标记方法缺陷的有效弥补，具有广阔的应用前景.然而，目前尚未发现CDDP分子标记在芒果种质资源上应用的研究报道[18-23].

本研究以芒果为供试材料，建立其稳定的CDDP反应体系并进行优化，再筛选引物，为开展芒果遗传亲缘关系分析、品种鉴定、分子生物育种等工作奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

以广西亚热带作物研究所资源圃内20份芒果种质(表1)的无病虫害和机械外伤的嫩叶为供试材料.采摘后立刻装入盛有冰块的泡沫盒内，带回实验室保存于-30 ℃的冰箱内[1].通过已知植物基因家族片段设计CDDP引物，引物共计21条(表2).

表1 供试芒果种质材料Table 1 Mango materials used in this study

表2 CDDP引物序列及其基本信息Table 2 Basic information of CDDP primers

1.2 DNA模板的提取与检测

参考张宇等[1]的方法，通过测定D230 nm、D260 nm、D280 nm检测DNA纯度；利用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA浓度，并于-30 ℃冰箱内保存DNA模板，备用.

1.3 CDDP反应体系的建立与优化

参照文献[24-25]的方法，将模板DNA浓度、含Mg2+DNA聚合酶用量、dNTPs浓度、引物浓度4个因子设置4个梯度水平，采用L16(44)正交设计(表3)对芒果CDDP-PCR进行体系优化，3次重复，每个处理总体积均为20 μL.

表3 芒果CDDP-PCR反应的L16(44)正交试验设计Table 3 Factors and levels of L16(44) orthogonal design for mango CDDP-PCR reaction

1.4 CDDP-PCR扩增程序及稳定性验证

PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，退火50 s，72 ℃延伸2 min，循环40个；72 ℃后延伸8 min，10 ℃保温.用于PCR体系优化的引物为Myb1(5′-GGCAAGGGCTGCCGC-3′).PCR扩增结束后，取8 μL扩增产物，加入1.5 μL 上样缓冲液，将1.8%(质量分数)琼脂糖凝胶(含荧光核酸燃料)放入Tris硼酸电泳缓冲液中电泳.电泳后，用凝胶成像仪拍照，观察电泳结果.选取引物(表2)，按上述扩增程序反复筛选引物.

2 结果与分析

2.1 芒果CDDP反应体系的正交优化分析

由芒果CDDP-PCR正交优化设计电泳凝胶结果(图1)可知，不同水平处理中各因素组合的不同，导致其扩增结果差异较大.其中，处理9、12无扩增条带；处理1扩增条带微弱、模糊；处理13、16扩增条带较少；其余处理均可扩增出符合后续试验要求的条带，其中处理7、10扩增条带多且整齐、清晰.

M.DNA Marker DL2000 bp;1～16.组合编号见表4.图1 芒果CDDP-PCR正交试验设计L16(44)电泳结果(引物mby1)Fig.1 Electrophoresis analysis of CDDP-PCR product for mango with primer mby1

将影响CDDP-PCR的4个因素分别设置4个梯度水平(表3)，采用L16(44)正交设计对芒果CDDP-PCR反应体系进行组合优化.利用扩增条带数目、整齐度、层次感及底色等指标进行直观分析，3次评分取均值[26]；求出同一水平下的每个因素的均值，再求出最大均值与最小均值之差，最终求级差R.R值越小表明该因素的影响越弱.从表4可知，在所设计的组合试验中，含Mg2+DNA聚合酶用量对CDDP扩增反应体系结果影响最大，dNTP浓度次之，模板DNA浓度的影响最小.方差分析结果(表5)也显示，除DNA用量之外，其他因素对试验结果的影响都达到了显著水平.

表4 芒果CDDP-PCR反应正交试验L16(44)结果均值1)Table 4 Result of orthogonal test for mango CDDP-PCR reaction

1)k1～k4:各因素各水平下的得分数据平均值.

表5 芒果CDDP-PCR反应体系正交设计方差分析1)Table 5 Variance analysis of orthogonal design of mango CDDP-PCR

1)*表示差异达0.05显著水平.

2.2 CDDP-PCR扩增效果验证及引物的筛选

应用优化后的反应体系(表3)和Myb1引物对20份芒果种质(表1)进行CDDP-PCR扩增.20个芒果品种均可扩增出明晰且稳定的条带(图2).扩增图谱既显示了芒果种内的稳定遗传特性，又显示了品种间的遗传多样性，表明该优化体系适用于芒果CDDP-PCR分析.利用20份芒果种质(表1)对21条CDDP引物进行多态性筛选(图3).从图3可知，21条CDDP引物均适用于芒果CDDP-PCR扩增.

M.DNA Marker DL2000;1～20.分别对应表1中各品种.图2 引物mby1对20个芒果品种的CDDP-PCR扩增Fig.2 Electrophoresis analysis of CDDP-PCR product for 20 mango germplasms with primer mby1

M.DNA Marker DL2000;1～21.分别对应表2中各引物.图3 21条CDDP引物对汤米的PCR扩增Fig.3 Electrophoresis analysis of CDDP-PCR product for Tommy with 21 CDDP primers

3 讨论

与已报道的其他DNA标记技术相比较，CDDP标记可以更全面更细致地反映物种间的遗传关系[27]，这得益于CDDP-PCR反应体系各因素最佳的优化组合.单因素多水平逐级优化法只是针对研究PCR反应体系中一个因素遵守某些规律变化时对反应结果的影响，却忽略了最重要的反应体系各因素之间的相互影响.这对推测反应体系最佳组合有很大的片面性，因此并不能确定单一因素的最佳浓度就是最佳浓度组合反应体系，更无法反映多因素对反应体系的相互影响[28].与单因素PCR优化设计相比，正交优化设计法能够在较短的时间内获得理想的试验结果，同时考虑了各因素间的综合效应，也减轻了工作强度.应东山等[29]利用正交设计优化了适合芒果SRAP-PCR的较佳反应体系[30-31].本研究利用正交设计试验对芒果CDDP-PCR的反应体系进行了优化及筛选引物，各因素不同水平组合(表3、图1)形成的反应体系扩增结果差异性大.处理9、12肉眼无法观察到扩增条带，其他组合均有扩增条带出现，处理1 扩增条带微弱，处理13、16扩增条带较少.综合考虑扩增条带数量、特异性、亮度、整齐度和底色等因素，对CDDP-PCR扩增结果进行综合评价，处理7和处理10扩增条带数量多、清晰度高、特异性强.

Mg2+本身并不参与PCR扩增反应，但却是PCR扩增反应中不可或缺的催化剂，催化DNA聚合酶的活性.Mg2+用量过少或过多时，可以减弱或增强DNA聚合酶的活性，使得扩增条带变少，或引起非特异性扩增.从表3、图1可知，当Mg2+浓度为1.50 U时，处理9、12肉眼无法观察到扩增条带；当Mg2+用量为1.00 U时，16个组合设计均可观察到扩增条带，当Mg2+用量为2.00 U时，扩增条带分离度较差，所以含Mg2+DNA聚合酶用量选择1.00 U.当dNTPs浓度为0.30和0.40 mmol·L-1时，均可扩增出差异性条带.dNTPs是进行PCR扩增的原料，是生成特异序列不可或缺的碱基，浓度过低时扩增条带不够充分；浓度过高时，容易形成聚合体，增加错配率，而使得条带的层次感欠缺，不利于后续分析.因此当dNTPs浓度过低或者过高时，要么扩增条带微弱稀少，要么扩增条带存在扫把状.遵循材料最省原则，当dNTPs浓度为0.30 mmol·L-1时扩增效果较佳.引物浓度取0.40、0.60、0.80、1.00 μmol·L-14个水平，引物为0.40 μmol·L-1时出现的扩增条带少且弱，说明0.4 μmol·L-1引物浓度不能充分完成PCR扩增反应.由于引物量的缺少而不能锚定引物位点，因而许多扩增条带未能得到充分扩增、展示.扩增效果较好的2个处理的引物浓度均为1.00 μmol·L-1，遵循扩增效果最佳原则，选择的最佳引物浓度为1.00 μmol·L-1.PCR扩增是以适宜的模板DNA浓度为前提的，当模板DNA浓度过低或者过高时，扩增结果会出现条带少、弱或者非特异性条带增多的现象.条带少、弱是因为PCR反应中没有充足的原料，无法充分进行PCR扩增反应.非特异性扩增产物增多是因为重复扩增已有条带，CDDP反应体系对模板DNA浓度敏感度低(表4、5)，基于原料最省和效果最佳原则，选取0.50 ng·μL-1为最佳反应水平.通过直观分析法可知，R值的大小表示因素对结果影响的大小(表4).在正交优化试验的4个因素中，对体系结果影响大小表现为：含Mg2+DNA聚合酶用量>dNTPs浓度>引物浓度>模板DNA浓度.较佳的芒果CDDP-PCR反应体系为：1.00 U含Mg2+DNA聚合酶、0.40 mmol·L-1dNTPs浓度、1.00 μmol·L-1引物浓度、0.50 ng·μL-1模板DNA用量，加双蒸水使得总体积达到20.00 μL.本研究结果表明目前所有CDDP引物均适用于芒果的遗传多样性分析.

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(责任编辑:叶济蓉)

OrthogonaloptimizationofCDDP-PCRsystemandprimerscreeningformango

ZHANG Yu, HUANG Guodi, HUANG Qiang, MO Yonglong, QIN Xu, GUO Limei
(Guangxi Subtropical Crops Research Institute, Nanning, Guangxi 530001, China)

S667.7

1671-5470(2017)05-0546-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.05.011