粤北地区仔猪腹泻源大肠杆菌毒力基因检测及致病性初步研究

南文金，黄健强，吴静波，胡鸿惠，彭国良，肖正中

（1. 韶关学院动物疫病实验室，广东 韶关 512005；2. 粤北生猪生产及疫病防控协同创新发展中心，广东 韶关 512005）

粤北地区仔猪腹泻源大肠杆菌毒力基因检测及致病性初步研究

南文金1，2，黄健强1，2，吴静波1，2，胡鸿惠1，2，彭国良2，肖正中2

（1. 韶关学院动物疫病实验室，广东 韶关 512005；2. 粤北生猪生产及疫病防控协同创新发展中心，广东 韶关 512005）

采用PCR方法对56株仔猪黄白痢源大肠杆菌肠毒素和耶尔森菌强毒力岛（HPI）相关毒力因子STa、STb、LT和irp2进行检测，进而根据毒力因子基因型对部分菌株进行致病性试验。结果显示，38株受试菌检测到毒力因子，其中STa基因阳性率为3.57%，STb基因阳性率为53.57%，LT基因阳性率为7.14%，irp2基因阳性率为21.43%，检测的毒力因子表现为5种基因型，主要的毒力因子基因型是STb和STb+irp2。致病性试验显示毒力基因阳性菌株均对小白鼠具有致病性。结果表明，粤北地区致仔猪黄白痢大肠杆菌流行的主要毒力因子为STb，其次为irp2、少数菌株携带STa和LT毒力因子，相关毒力基因检测可以作为快速确定大肠杆菌致病性的重要依据。

大肠杆菌；肠毒素；强毒力岛；毒力基因；致病性

Abstract：Enterotoxin virulence-related gene （STa，STb and LT） and HPI gene （irp2） of 56 strains of Escherichia coli isolated from piglets with diarrhea were detected by corresponding PCR，and part of strains were chosen according to virulence factors gene-type for animal pathogenicity test. The results showed that 38 strains had virulence genes，the positive rates of STa，STb，LT and irp2 genes respectively were 3.57%，53.57%，7.14% and 21.43%. There were 5 virulence factors genotypes，the major genotypes were STb and STb+irp2.The pathogenicity test showed that positive strains had pathogenicity to mice. In north Guangdong，the major virulence factors of pathogenic E. coli from diarrhea piglets were STa and irp2，a few strains carried STa and LT，some isolates expressed two virulence factors. Detection of virulence genes was an important reference for rapid determining pathogenicity of E. coli.

Key words：Escherichia coli；enterotoxin；high pathogenicity island；virulence genes；pathogenicity

大肠杆菌是一种重要人兽共患病原菌，原发或继发感染致病性大肠杆菌引起的仔猪腹泻（黄白痢）是养猪生产中常见的一种细菌性疾病［1］。大肠杆菌是一种条件性致病菌，常由阴冷潮湿、昼夜温差大、转群换料等环境和应激因素导致仔猪发病和死亡。大肠杆菌引起的仔猪腹泻因发病日龄不同表现出不同的临床症状和特点，仔猪黄痢主要发生在7日龄内新生仔猪，仔猪白痢主要发生在1周龄到断奶哺乳仔猪［2］。猪场发生仔猪黄白痢，如果控制措施不科学及时，往往导致病原在分娩舍传播，仔猪大批死亡。

产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是导致仔猪发生黄白痢的主要致病性大肠杆菌，ETEC主要毒力因子是菌毛和肠毒素，大肠杆菌通过菌毛在肠道组织上皮细胞定殖，定殖到肠道组织上皮细胞的大肠杆菌繁殖过程产生的肠毒素相关毒力因子（STa、STb和LT）是造成仔猪腹泻直接原因［3-4］。此外，研究表明，携带HPI的大肠杆菌也是导致人和多种动物腹泻重要毒力因子［5］。

为了解粤北地区仔猪黄白痢大肠杆菌主要毒力因子流行情况，丰富我国大肠杆菌分子流行病学资料，本试验对分离自粤北地区疑似仔猪黄白痢病的致病性大肠杆菌进行毒力因子STa、STb、LT和irp2（HPI标志性基因）进行检测，以期掌握粤北地区仔猪腹泻源大肠杆菌毒力因子流行情况以及基因型，分析菌株致病性和毒力因子间关系，丰富有关猪源大肠杆菌分子流行病学资料，为该病的防控及新型疫苗研究方向提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌株：大肠杆菌参考菌株C83903（LT+、STb+），C83920（STa+）购自中国兽药监察所，由韶关学院动物疫病实验室保存，HPI+参考菌株为该实验室经过测序鉴定的一株irp2基因阳性的猪源大肠杆菌；试验用大肠杆菌为2015—2016年分离自粤北地区多个猪场疑似黄白痢病的仔猪粪便和肠道内容物中，经生化试验和分子鉴定为大肠杆菌。

主要试剂：麦康凯培养基、营养肉汤为广东环凯微生物科技有限公司产品；2×PCR Mix、DNA Marker为广州东盛生物科技有限公司产品；琼脂糖为sigma公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 引物序列 参照文献［6-7］合成用于扩增大肠杆菌毒力基因STa、STb、LT和irp2的引物序列（表1），引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

表1 大肠杆菌毒力基因扩增引物序列

1.2.2 DNA 模版制备 参考菌株和试验菌株接种于麦康凯培养基上，37℃ 培养过夜，挑取单个菌落接种于营养肉汤培养基中，37℃、180 r/min 摇床震荡培养16 h，取培养物1.5 mL，10 000 r/min离心5 min，弃上清，加入0.2 mL灭菌去离子水用振荡器重悬菌体，水中煮沸10min，12 000 r/min离心5 min，吸取上清于另一只灭菌的1.5 mL离心管中，-20℃冰箱中保存备用。

1.2.3 PCR反应条件优化 在20 μL的PCR反应体系中加入2×PCR Mix 10 μL，参考菌株DNA模版2 μL，10 pmol/μL的上下游引物各1 μL，超纯水6 μL，对4对引物PCR扩增退火温度进行优化试验，确定最佳退火温度。

1.2.4 毒力因子检测 用优化后的PCR反应条件对56株试验大肠杆菌STa、STb、LT和irp2等4种毒力因子进行扩增，PCR扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.5 致病性试验 选择携带STa、STb、LT和irp2毒力因子基因型不同受试菌各一株，未检测到毒力因子的受试菌中选择3株来源不同猪场分离菌株，共计8个试验菌株分别接种于营养肉汤中，37℃ 摇床震荡培养到对数生长期（约8 h），取0.5 mL 培养菌液10 000 r/min离心5 min，弃上清，加入灭菌生理盐水重悬菌体，离心弃上清，反复3次，最后用0.5 mL生理盐水稀释菌体，腹腔接种健康昆明小鼠，每一个菌株同时接种3只小鼠，另设生理盐水对照，每组处理分笼饲养在相同环境中。

2 结果与分析

2.1 肠毒素相关毒力因子检测

运用PCR方法对56株试验大肠杆菌肠毒素毒力因子STa、STb、LT基因分别进行扩增，PCR产物凝胶电泳检测结果显示，STa基因阳性菌2株，STb基因阳性菌30株，LT基因阳性菌4株，占受试菌株的比例分别为3.57%、53.57%、7.14%（图1）。检测结果表明在粤北地区仔猪黄白痢源大肠杆菌主要流行肠毒素毒力因子为STb，仅少数菌株携带STa、LT基因。

图 1 STa基因、STb基因和PLT基因CR扩增

2.2 强毒力岛检测

运用PCR方法对56株试验菌株HPI标志基因irp2进行扩增，PCR产物凝胶电泳检测结果显示，有12株试验菌株为阳性，占受试菌株的21.43%（图2）。检测结果表明，HPI阳性菌株在仔猪黄白痢源大肠杆菌中也占有一定比例，应加强对该类菌株对仔猪危害性研究与评估。

2.3 毒力因子基因型

图2 irp2基因PCR扩增

56株试验菌株中有38株为ETEC或HPI毒力基因阳性菌株，将阳性菌株按携带STa、STb、LT和irp2等4种毒力因子种类进行分类，共组成5种毒力基因型，为单独携带一种毒力因子或同时携带两种毒力因子，其中以仅携带STb毒力基因的为主要毒力基因型，其次为STb+irp2基因型（表2）。基因型结果分析表明，ETEC和HPI毒力基因阳性菌株虽然组成5种毒力基因型，但携带单一毒力因子占菌株数量73.68%（28/38），在携带两种毒力基因的菌株中，以同时携带一种肠毒素基因（STb）和强毒力岛基因（irp2）为主，未发现同时携带3种以上毒力基因的菌株。

表 2 ETEC和HPI阳性菌毒力因子基因型

2.4 致病性试验

STa、STb、LT和irp2 等4种毒力因子组合的5个毒力基因型菌株在8～48 h内致接种小鼠发病死亡，死亡高峰在12～24 h间。接种未携带以上4种毒力因子菌株的3组小鼠中有1组小鼠也在48 h内发病死亡，其余2组和对照组小鼠正常生长。动物致病性试验结果表明，通过检测相关毒力因子可以为临床仔猪黄白痢快速诊断提供依据，但毒力基因型与菌株毒力间关系还需要进一步研究。

3 结论与讨论

通过对大肠杆菌肠毒素和耶尔森菌强毒力岛相关毒力因子检测，明确了粤北地区致仔猪黄白痢大肠杆菌流行的主要毒力因子为STb，其次为irp2、少数菌株携带STa和LT毒力因子，致病性相关试验表明毒力基因检测方法对仔猪大肠杆病的快速诊断有重要参考价值。

定殖于仔猪肠道上皮细胞的产肠毒素大肠杆菌（ETEC）繁殖过程中产生和释放肠毒素，肠毒素改变肠道细胞的吸收和分泌功能，引起血管内皮细胞损伤，从而导致大量水分和电解质流向肠腔，临床上表现为水样腹泻，因此，肠毒素是导致腹泻的直接毒力因子［3，8］。从仔猪黄白痢样品中分离大肠杆菌并快速确定其是否为致病菌株，根据致病菌株药敏试验结果采用有效的药物防控该病传播在生产实践中有重要意义，而对临床分离菌株肠毒素相关基因检测可以快速确定是否为ETEC菌株的重要依据［9］。

肠毒素主要分为耐热肠毒素（STa和STb）和不耐热肠毒素（LT）［1］。本研究检测的大肠杆菌STb基因阳性率为53.75%，要远远高于STa和LT阳性率。这一结果和2012年苏中地区以及2014年山西猪源大肠杆菌肠毒素毒力因子分布报道有一致性［10-11］，都为STb阳性率要高于STa和LT。但这两个地区报道的STa和LT阳性率都要高于本研究对粤北地区调查结果。陈祥等［12］2003年对江苏、江西、安徽等华东地区初生仔猪腹泻源大肠杆菌肠毒素相关基因进行检测，主要肠毒素基因为STa和STb，分别占分离菌株的51.72%和37.24%；近几年陕西省部分地区以及上海仔猪腹泻源大肠杆菌主要毒力因子是STa，少量分离菌株中检测到STb和LT毒力因子［8，13］；2015年皖北地区仔猪大肠杆菌毒力因子检测结果显示STa和STb比例分别为8.82%和5.88%，两种耐热肠毒素毒力因子流行率差别不大［14］。此外，以上不同地区的调查报道中都可以检测到少数同时表达两种或以上肠毒素毒力因子的菌株，这和本试验结果相同。以上数据比较分析可知，不同地区猪源大肠杆菌的肠毒素毒力因子流行情况不同，这种差异除受到空间影响外，是否和时间因素有关不得而知，因为我国对猪源大肠杆菌肠毒素毒力因子流行病学报道相对较少，更缺乏一定区域内比较系统的猪大肠杆菌毒力因子分子流行病学监测研究，相关报道都是个别地区一个较短时期内猪大肠杆菌毒力因子流行病学调查。

HPI毒力岛最早发现于耶尔森菌属，后来发现在多种肠杆菌属的细菌中存在，是导致人和多种动物腹泻的一种重要毒力因子［15-16］。irp2基因是HPI 毒力岛主要结构蛋白，可以作为检测HPI的标志基因［9］。本试验菌株irp2基因阳性率为21.43%，低于高小攀等对仔猪腹泻样品中irp2阳性率达到62%报道，但高于山西和广东猪源大肠杆菌的HPI阳性率15.5%和16.51% 报道［11，17］。分析产生以上差异原因主要有两个方面，首先是不同地区HPI毒力岛流行情况差异，其次是检测使用的样品类型，样本DNA来源于仔猪腹泻样品还是分离鉴定的菌株、菌株是否具有致病性都可能对检测结果有影响。

大肠杆菌菌株中检测到的4种毒力因子STa、STb、 LT和 irp2占受试菌的67.86%（38/56），ETEC和HPI阳性菌株毒力因子基因型有5种，其中STb和STb+irp2两种基因型组合占阳性菌株近80%，是该地区仔猪黄白痢大肠杆菌主要毒力基因型。动物致病性试验结果表明携带毒力因子菌株均可致健康昆明小白鼠发病死亡，因致病性试验中未对接种细菌浓度进行测定，只能初步证明菌株是否具有致病性结论，其毒力因子及其基因型与菌株毒力强弱间关系还需进一步研究。部分没有检测到肠毒素和毒力岛相关毒力基因的菌株对小鼠致病性可能是由其他毒力因子导致的，如粘附素、内毒素、外膜蛋白、溶血素、寡肽毒素等都能导致动物发病［18］。

开展大肠杆菌毒力因子检测及分子流行病学调查研究，不但可以为该病的诊断防控、基因工程疫苗研究方向提供依据，同时大肠杆菌是一种重要人兽共患病原菌，研究发现大肠杆菌携带的某些毒力因子可能和细菌耐药性也有关系［19］，表达重要毒力因子的动物源大肠杆菌可以通过食物链传递和扩散给人类，对人类健康带来隐患和威胁［20］。所以，开展不同动物源的大肠杆菌毒力因子流行病学检测研究，对畜牧业生产和公共卫生都具有重要意义。

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（责任编辑 杨贤智）

Detection of virulence genes of Escherichia coli strains isolated
from piglets with diarrhea in north Guangdong and
preliminary study on their pathogenicity

NAN Wen-jin1，2，HUANG Jian-qiang1，2，WU Jing-bo1，2，HU Hong-hui1，2，PENG Guo-liang2，XIAO Zheng-zhong2
（1. Laboratory of Animal Disease，Shaoguan University，Shaoguan 512005，China；2.North Guangdong Collaborative Innovation and Development Center of Pig Farming and Disease Control，Shaoguan 512005，China）

S852.61

A

1004-874X（2017）06-0129-06

南文金，黄健强，吴静波，等.粤北地区仔猪腹泻源大肠杆菌毒力基因检测及致病性初步研究［J］.广东农业科学，2017，44（6）：129-134.

2017-04-08

广东省科技计划项目（2017A020225044，2016A040402038）；广东省现代农业科技创新联盟建设项目（2016LM1141）；韶关市科技计划项目（2013CX/N09）

南文金（1981-），男，硕士，助理研究员，E-mail：nanwenjin@126.com

彭国良（1965-），男，硕士，研究员，E-mail：pengguoliang168@163.com