响应面分析法优化山楂多糖的提取工艺

李丹丹，周杰，牟德华，李艳，曹灿，王巍

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018；2.河北冠卓检测科技有限公司，河北石家庄050000）

响应面分析法优化山楂多糖的提取工艺

李丹丹1，周杰2，牟德华1，李艳1，曹灿1，王巍1

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018；2.河北冠卓检测科技有限公司，河北石家庄050000）

以山楂为原料，对山楂多糖的影响因素及工艺进行优化研究。采用热水浸提方法，分析提取时间、温度、液料比对提取山楂多糖的影响。采用硫酸-苯酚法测定山楂多糖，根据响应面进行优化分析，确定山楂多糖的最优提取条件为：液料比25∶1（mL/g）、提取温度90℃、提取时间93 min。该条件下山楂多糖的得率为53.77%。该提取工艺操作简单，稳定性好，适用于工业化生产。

山楂；多糖；提取工艺；响应面分析法

Abstract：The extraction process for polysaccharide in hawthorn was optimized.With water as extraction solvent，the effect of extraction time，extraction temperature and liquid-solid ratio on the yield of polysaccharide were optimized with single factor test followed by response surface methodology.The results of optimal extraction conditions for polysaccharide was given.The solid-liquid ratio was 25∶1（mL/g），temperature was 90℃，the extraction time was 93 min.Under this condition，the extraction yield of hawthorn polysaccharide was 53.77%.The extraction process was simple and reasonable，suitable for industrial production.

Key words：hawthorn；polysaccharides；extraction process；the response surface methodology

山楂为蔷薇科苹果亚科落叶灌木山里红和北山楂的干燥成熟果实。山楂果实中含有糖类、氨基酸类、黄酮类化合物、黄烷及其聚合物类、三萜类化合物和有机酸类等多种化学成分[1-3]，具有抗氧化、降压、降血脂、防癌、抗菌消炎等方面功效，是一种药食兼用的水果[4-5]。

多糖作为生命有机体的重要组成部分，对维持生命所需的多种生理功能有很重要的意义。目前对多糖的研究可知，多糖具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、降血糖、降血脂等一系列的生物活性[6-10]，这对于药物的研发和食品的加工很有帮助，所以近年来，功能性多糖的研究越来越受到受关注。本研究以山楂为研究对象，以水溶性多糖得率为指标，对山楂多糖的提取工艺进行了单因素试验和响应面优化，探讨其多糖提取最佳工艺条件，为深入开发山楂资源提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

鲜山楂：河北省兴隆县大果山楂。

1.1.2 试剂

葡萄糖（AR）：天津市百世化工有限公司；浓硫酸（AR）：新光化工试剂厂；苯酚（AR）：天津市大茂化学试剂厂。

1.1.3 仪器

KQ5200DE型数控超声波清洗器：中国江苏昆山市超声仪器有限公司；JJ1000型精密电子天平：美国双杰兄弟集团有限公司；101-OAB型电热鼓风干燥箱：中国天津市泰斯特仪器有限公司；V-5000可见分光光度计：上海市元析仪器有限公司；QL-901型涡旋振荡器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；HH-2型数显恒温水浴锅：金坛市杰瑞尔电器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料预处理

将鲜山楂果洗净，去核、切成薄片后在50℃下干燥至恒重，研磨过120目筛子，称重备用。

1.2.2 多糖提取工艺路线

准确称取4.00 g山楂粉，按一定的液料比加蒸馏水，恒温水浴浸提，抽滤取滤液，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。

1.2.3 多糖的测定

分别移取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的葡萄糖标准液，分别置于6支洁净的试管中，加入蒸馏水补充至2 mL，按顺序依次加入1 mL 5%的苯酚溶液，摇匀，分别迅速加入浓硫酸5 mL，用涡旋振荡器摇匀，室温静置10 min，然后20℃水浴20 min。以不加葡萄糖标准溶液的试管作为对照，在波长为490 nm处测定其它试管的吸光度。以葡萄糖标准溶液的质量浓度为X轴，测得的吸光度为Y轴，绘制葡萄糖的标准曲线。直线方程为y=0.013 3x+0.066 8（R2=0.999）。

先将山楂多糖的提取液分别吸出0.2mL于100mL的容量瓶中定容、摇匀，在从稀释后的液体中分别取出2 mL于洁净的试管中，按顺序依次加入1 mL 5%的苯酚溶液，摇匀，分别迅速加入浓硫酸5 mL，用涡旋振荡器摇匀，室温静置10 min，然后20℃水浴20 min，在波长为490 nm处测定其它试管的吸光度。

1.2.4 山楂多糖得率的计算

式中：C为稀释后溶液的浓度，μg/mL；V为提取液的体积，mL。

1.2.5 单因素试验

准确称取4.00 g山楂粉，加入一定体积蒸馏水，水浴加热浸提一定时间，抽滤得提取液，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。分别以液料比、提取温度和提取时间3个因素为对象，考察其对山楂多糖得率的影响。

1.2.6 响应面优化设计

采用Design-Expert6.0.10Trial软件中的响应面试验设计原理设计响应面试验。选择提取时间A、温度B、液料比C，3个因素作为试验因素，以山楂总糖得率为响应值，从而确定最佳提取条件。

1.2.7 验证试验

为了进一步考察优选工艺的可靠性和稳定性，精密称取4.00 g山楂粉，在1.2.6确定的工艺条件下进行3次试验，验证所提取条件优化的稳定性。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取时间对多糖得率的影响

提取时间对多糖得率影响如图1所示。

图1 提取时间对多糖得率的影响Fig.1 The effect of extraction time on the yield of hawthorn polysaccharide

多糖的得率随着时间的延长呈现上升的趋势，提取时间为2 h多糖的得率达到最大可以达到50.06%，但是120 min以后延长时间对多糖的得率没有太大的影响。

2.1.2 提取温度对多糖得率的影响

提取温度对多糖得率影响如图2所示。

图2 温度对多糖得率的影响Fig.2 The effect of extraction temperature on the yield of hawthorn polysaccharide

多糖的得率随着温度的升高不断的增加，60℃～80℃，多糖的增加量显著，80℃之后随温度的增加，多糖的增加量变化不明显。主要是由于用水作为溶剂提取多糖时，随着温度的升高，分子的热运动加剧，分子的扩散速度增加，越来越多的多糖分子进入到水中，所以多糖得率会不断增加。

2.1.3 液料比对多糖得率的影响

液料比对多糖得率影响如图3所示。

图3 液料比对多糖得率的影响Fig.3 The effect of liquid-solid rate on the yield of hawthorn polysaccharide

随着液料比的增加多糖的得率有一个先增加后趋于平缓的一个趋势，10（mL/g）～30（mL/g）之间时多糖的得率是逐渐增加的，30（mL/g）之后趋于平缓。这是由于提取剂用量逐渐增大时，有效成分在提取剂中的浓度降低，物料及提取剂边界层的有效成分浓度差变大，主动扩散力增大，当多糖的溶出量几乎接近最大时继续增加提取剂的用量不再起明显的作用。

2.2 山楂多糖提取响应面法优化分析

2.2.1 优化处理

为了确定提取多糖试验的最优条件，在响应面分析软件中设定液料比、提取温度和提取时间这3个因素的取值范围如表1，试验结果见表2。

表1 响应面试验的因素和水平编码值Table 1 Coded factors and levels in quadratic regression rotational combinational design

表2 响应面分析的试验设计和试验结果Table 2 Response surface analysis design matrix and experimental results

利用响应面分析法对表2的试验数据进行分析，得到一个拟合二次多项式方程。该二次多项式方程为：得率=-216.840 75+1.880 15A+0.707 83B+9.987 25C-6.068 89×10-3A2+4.605 00×10-3B2-0.169 98×C2-7.541 67×10-3AB-2.916 67×10-3AC-0.011 700×BC

2.2.2 模型方差分析

方差分析结果见表3。

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance for fitted quadratic polynomial model

由表3可知，该方程模型是显著的，失拟项比F值不显著，方程的F值为6.45，P＜0.1，表示该因素对山楂多糖提取量影响是显著的。由表3可知，A、B、A2、C2项的影响是显著的，而C、B2、AC、AB和BC项山楂多糖提取量影响是不显著的。3个试验条件（A：提取时间；B：温度；C：液料比）对提取量影响的主次顺序为：B＞A＞C。

2.2.3 响应面分析

山楂多糖提取工艺中提取时间、温度和液料比3个因素之间交互作用对山楂多糖得率的影响见图4、图 5、图 6。

由图4、图5、图6可知，每个因素都有双向增长，即因素值增大则响应值增大；当因素取值增大到一定值时，响应值达到极值，之后随着因素的增大，响应值逐渐减小；通过对3个图形对比来看，温度（B）对水浴法提取多糖的影响最为显著。通过对响应面图的分析得出山楂多糖的最优提取条件为：液料比25∶1（mL/g）、温度90℃、提取时间93 min，最优条件下多糖的得率为53.77%。

图4 提取时间和温度对山楂多糖得率的响应面图Fig.4 Response surface plot showing the effects of extraction time and temperature on the yield of hawthorn polysaccharide

图5 提取时间和液料比对山楂多糖得率的响应面图Fig.5 Response surface plot showing the effects of extraction time and liquid-solid rate on the yield of hawthorn polysaccharide

图6 提取温度和液料比对山楂多糖得率的响应面图Fig.6 Response surface plot showing the effects of extraction temperature and liquid-solid rate on the yield of hawthorn polysaccharide

2.2.4 响应面分析法预测值的验证

按照响应面软件得到的最优条件，在最优条件下进行3组平行试验验证其可靠性。由响应面分析法可得到优化的试验条件：液料比25∶1（mL/g）、温度90℃、提取时间93 min，进行3次平行试验，测提取多糖得率分别为53.76%、53.78%和53.78%，平均值为53.77%。试验证明，此工艺稳定，重复性好。

3 结论

利用水提法提取多糖具有能耗低、省时、不破坏有效成分等优点，该工艺合理、成熟，有较高的开发价值。通过单因素试验以及响应面优化，试验提取出各因素对山楂多糖提取效果的影响程度为提取温度＞提取时间＞液料比。确定山楂多糖水提法提取多糖最佳工艺条件为：液料比 25∶1（mL/g）、温度 90℃、提取时间93 min。

[1]赵功宝.山楂中化学成分鉴定分析[J].广东化工,2015,42(24):78-79,101

[2]吴士杰,李秋津,肖学凤,等.山楂化学成分及药理作用的研究[J].药物评价研究,2010,33(4):316-319

[3]刘荣华,邵峰,邓雅琼,等.山楂化学成分研究进展[J].中药材,2008,31(7):1100-1103

[4]李刚,梁新红,葛晓虹.山楂化学成分及其保健功能特性[J].江苏调味副食品,2009,26(6):25-27,30

[5]QiaoAimin,Wang Yihai,Xiang Limin,et al.Novel triterpenoids isolated from hawthorn berries functioned as antioxidant and antiproliferative activities[J].Journal of Functional Foods,2015,13:308-313

[6]王迎进,闫军,周俊丽,等.酸枣叶多糖抗氧化性研究[J].食品研究与开发,2013,34(7):92-94

[7]Yang Tao,Zhang Shaopeng,Wang Rufeng,et al.Polysaccharides from Rhizoma Panacis Majoris and its anti-oxidant activity[J].International Journal of Biological Macromolecules,2016,86:756-763

[8]Li Chao,Huang Qiang,Fu Xiong,et al.Characterization,antioxidant and immunomodulatory activities of polysaccharides fromPrunella vulgarisLinn[J].International Journal of Biological Macromolecules,2015,75:298-305

[9]Mao Guang-Hua,Ren Yi,Feng Wei-Wei,et al.Antitumor and immunomodulatory activity of a water-soluble polysaccharide fromGrifolafrondosa[J].Carbohydrate Polymers,2015,134:406-412

[10]罗祖友,胡筱波,吴谋成.植物多糖的降血糖与降血脂作用[J].食品科学,2007,28(10):596-600

Optimization of Extraetion of Polysaccharides from Hawthorn Using Response Surface Methodology

LI Dan-dan1，ZHOU Jie2，MOU De-hua1，LI Yan1，CAO Can1，WANG Wei1
（1.College of Bio-engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，Hebei，China；2.Hebei Guanzhuo Detection Co.，Ltd.，Shijiazhuang 050035，Hebei，China）

2016-03-18

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.010

河北省重点研发计划（17237103D）

李丹丹（1981—），女（满），副教授，博士，研究方向：碳水化合物与生物技术研究。