食管鳞癌组织miR-106b、Smad7表达变化及其与患者临床病理特征和预后的关系

韩东，杜炜，刘东海，林庆禄

(1 单县中心医院，山东菏泽274300；2 济宁市第一人民医院；3 中国人民解放军第88医院)

食管鳞癌组织miR-106b、Smad7表达变化及其与患者临床病理特征和预后的关系

韩东1，杜炜1，刘东海2，林庆禄3

(1 单县中心医院，山东菏泽274300；2 济宁市第一人民医院；3 中国人民解放军第88医院)

目的探讨组织微小RNA-106b (miR-106b)、信号转导分子7(Smad7)在食管鳞癌发生、发展中的作用。方法选择食管鳞癌组织及其配对的癌旁正常组织各97例份。采用qRT-PCR法检测食管鳞癌组织及癌旁正常组织miR-106b、Smad7 mRNA表达，分析二者的关系及其与患者临床病理参数和预后的关系。结果食管鳞癌组织miR-106b相对表达量高于癌旁正常组织，Smad7 mRNA相对表达量低于癌旁正常组织(P均<0.05)。相关性分析显示，食管鳞癌组织miR-106b与Smad7表达呈负相关(r=-0.778，P<0.05)。miR-106b、Smad7表达与食管鳞癌患者临床分期、组织分化程度、淋巴结转移均有关(P均<0.05)，与性别、年龄、肿瘤直径及浸润深度均无关(P均>0.05)。生存分析显示，miR-106b高表达、Smad7低表达患者预后较差(P均<0.05)。结论miR-106b、Smad7异常表达与食管鳞癌的发生、发展及预后有关，Smad7可能是miR-106b的负性调控靶基因。

食管肿瘤；鳞状细胞癌；微小RNA-106b；信号转导分子7

食管癌是临床常见的恶性肿瘤之一，在我国以食管鳞状细胞癌(以下称食管鳞癌)为主[1]。目前，食管癌的治疗主要是以手术、化疗、放疗等为主的综合治疗，虽然已经取得了长足的进步，但患者预后仍然较差[2]，绝大多数患者死于肿瘤的复发与远处转移。近年来，分子靶向治疗在恶性肿瘤的治疗中取得了一定成果，但迄今为止尚无对食管癌有效的靶向药物。信号转导分子7(Smad7)是抑制性信号转导分子(Smad)蛋白，可抑制转化生长因子β(TGF-β)/Smad信号通路介导的生物学效应，在细胞和组织生长发育过程中具有重要作用[3]，其异常表达可能参与多种恶性肿瘤的发生、发展。近年研究发现，Smad7与微小RNA(miRNA)关系密切[4，5]。miR-106b是miRNA家族成员之一，有研究证实，miR-106b可通过作用于Smad7调控肿瘤细胞的恶性生物学行为[6，7]。但miR-106b、Smad7在食管鳞癌组织中的表达情况目前研究甚少。本研究探讨miR-106b、Smad7在食管鳞癌发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2009年1月～2010年12月济宁市第一人民医院收治的食管鳞癌患者97例。所有患者行食管癌根治术，术后组织病理检查明确诊断，临床资料及术后随访资料完整。排除术前接受过任何抗肿瘤治疗者或合并有其他器官恶性肿瘤者。其中，男70例、女27例，年龄(64.11±4.59)岁，肿瘤直径：≥5 cm 46例、<5 cm 51例，临床分期：Ⅰ期4例、Ⅱ期50例、Ⅲ期43例；组织分化程度：低分化40例、中高分化57例；浸润深度：黏膜或黏膜下层9例、肌层或外膜88例；有淋巴结转移35例，无淋巴结转移62例。本研究经济宁市第一人民医院伦理委员会批准，患者及家属均知情同意。

1.2 食管鳞癌组织及其癌旁正常组织miR-106b、Smad7 mRNA表达检测 采用qRT-PCR法。取食管鳞癌患者术后癌组织及其配对的癌旁正常组织(距肿瘤边缘3～5 cm)石蜡包埋标本，按照RNeasy石蜡包埋组织RNA提取试剂盒说明书提取组织总RNA，紫外分光光度计检测总RNA浓度和纯度，A260/A280为1.9～2.1。根据RNA逆转录试剂盒说明书逆转录为cDNA，然后进行PCR扩增。PCR引物序列：miR-106b上游引物：5′-TTTTCGCCCTTAGC-GTGAAGA-3′，下游引物： 5′-GAGGCAGTCGAAGCT-CTCG-3′；内参U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物： 5′-AACGCTTCACGAATTTGCG-T-3′；Smad7上游引物：5′-TGAGGGUGACCCAATUG-TTTAG-3′，下游引物：5′-GACAGUUUATGTUGTTGGT-3′；内参GAPDH上游引物： 5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。PCR反应体系共15 μL：cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL、Ultra SYBR Mixture 7.5 μL，DEPC水5.5 μL；反应条件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，共40个循环。分别以U6、GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-106b、Smad7 mRNA相对表达量。实验重复3次，取平均值。分析miR-106b与Smad7表达的关系及其与患者临床病理参数的关系。

1.3 预后情况 所有患者术后接受随访，随访截至2016年12月。以手术日开始至末次随访时间计算生存时间，研究结束、失访及其他原因死亡作为终点事件。以食管鳞癌组织miR-106b、Smad7 mRNA相对表达量的均值为临界值，采用Kaplan-Meier法分析miR-106b、Smad7高表达及低表达者的预后情况。

2 结果

2.1 食管鳞癌组织及其癌旁正常组织miR-106b、Smad7 mRNA表达比较 食管鳞癌组织miR-106b、Smad7 mRNA相对表达量分别为3.98±0.15、0.28±0.09，癌旁正常组织分别为1.02±0.03、1.03±0.02，二者比较P均<0.05。

2.2 食管鳞癌组织miR-106b与Smad7表达的关系 食管鳞癌组织miR-106b相对表达量与Smad7 mRNA相对表达量呈负相关(r=-0.778，P<0.05)。

2.3 miR-106b、Smad7表达与食管鳞癌患者临床病理参数的关系 见表1。

2.4 miR-106b、Smad7表达与食管鳞癌患者预后的关系 97例患者中miR-106b高表达55例、低表达42例，Smad7高表达40例、低表达57例。Kaplan-Meier生存分析显示，miR-106b高表达、Smad7低表达患者预后较差(P均<0.05)。

3 讨论

miRNA是一组高度保守的非编码单链小RNA分子，长度为18～25个核苷酸,可特异性与下游靶基因mRNA的3′-UTR区结合，调节靶基因表达，参与机体炎症反应、免疫应答及细胞增殖、凋亡等生理及病理过程[8,9]。已有研究证实，食管鳞癌的发生、发展与某些miRNA关系密切[10,11]。miR-106b是miR-106b～25基因簇家族成员之一，其定位于人染色体7q22，在多种恶性肿瘤中具有癌基因作用，如肝癌、胃癌、喉癌等[12～14]。Smad蛋白家族是TGF-β信号通路途径中的中心转导物质[15]，而TGF-β信号通路是EMT中最关键的信号通路[16]。Smad7是Smads家族的主要成员之一，是TGF-β/Smad信号通路负性调控的主要承担者，与多种恶性肿瘤的发生密切相关[4,5,17,18]。Salot等[19]研究发现，提高TGF-β通路的关键负性调控因子Smad7的表达能够明显抑制乳腺癌的浸润和转移。但目前miR-106b、Smad7在食管鳞癌组织中表达的研究甚少。

表1 miR-106b、Smad7表达与食管鳞癌患者临床病理参数的关系

注：miR-106b、Smad7表达与食管鳞癌患者临床分期、组织分化程度、淋巴结转移有关(P均<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤直径及浸润深度无关(P均>0.05)。

本研究结果显示，食管鳞癌组织miR-106b相对表达量均高于癌旁正常组织，与Xiao等[20]研究结果一致； 进一步分析发现，miR-106b表达与患者临床分期、组织分化程度、淋巴转移有关。提示miR-106b与食管鳞癌的发生、发展及转移可能有关。miR-106b参与肿瘤的发生、发展涉及多个信号通路。有研究证实，miR-106b在乳腺癌中可通过SIX1抑制Smad7，从而激活下游TGF-β通路，导致上皮细胞间质转化的发生，促进肿瘤发展[7]。Yu等[6]研究证实，胃癌组织中miR-106b表达与Smad7表达呈负相关关系，共同参与胃癌的发生、发展和转移。目前，关于食管癌组织miR-106b与Smad7表达的关系尚不明确。本研究结果显示，食管鳞癌组织miR-106b与Smad7表达呈负相关关系；进一步分析发现，Smad7表达与患者临床分期、组织分化程度、淋巴转移有关。提示miR-106b与Smad7共同参与了食管鳞癌的发生、发展和转移；miR-106b有可能通过负性调控Smad7在食管鳞癌的发生、发展中起调节作用，有可能成为食管鳞癌发生、发展的分子标志物及可能的基因治疗靶点。

有研究发现，miR-106b高表达的乳腺癌、肝癌等患者生存时间较短，预后较差[21，22]；Smad7低表达的前列腺癌患者生存时间较短，预后较差[23]。本研究结果显示，miR-106b高表达、Smad7低表达者预后较差。提示miR-106b、Smad7表达与恶性肿瘤患者的预后有关，可作为预测食管鳞癌患者预后的相关指标。

综上所述，食管鳞癌组织中miR-106b高表达、Smad7低表达，二者呈负相关关系；miR-106b、Smad7表达与食管鳞癌组织分化程度、临床分期、淋巴转移及预后密切相关；二者可能共同参与食管鳞癌的发生、发展及转移，Smad7可能是miR-106b的负性调控靶基因。

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林庆禄(E-mail: lin_1011peony@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.32.032

R571

B

1002-266X(2017)32-0095-03

2017-02-12)