长链非编码RNA-ROR在乳腺癌患者血清、癌组织中的表达变化及其临床意义

吴立春，谷仕艳，代黄梅，张莉，张遵真

(1四川省肿瘤医院，成都610041；2四川大学华西公共卫生学院)

长链非编码RNA-ROR在乳腺癌患者血清、癌组织中的表达变化及其临床意义

吴立春1,2，谷仕艳2，代黄梅2，张莉1，张遵真2

(1四川省肿瘤医院，成都610041；2四川大学华西公共卫生学院)

目的观察长链非编码RNA-ROR(lincRNA-ROR)在乳腺癌患者血清及癌组织中的表达变化，并探讨其临床意义。方法选择行手术切除治疗的乳腺癌患者120例作为观察组，其中早期55例、中晚期65例；90例体检健康女性作为对照组。收集观察组手术前后及对照组空腹静脉血，观察组手术切除的新鲜癌组织及其配对癌旁正常组织(各24例份)。采用实时荧光定量PCR法检测两组血清及组织lincRNA-ROR表达，电化学发光免疫分析法检测观察组早期乳腺癌患者和对照组血清糖类抗原153(CA153)、癌胚抗原(CEA)水平。采用受试者工作特征曲线分析血清lincRNA-ROR、CA153、CEA单独或联合检测对早期乳腺癌的诊断价值。结果观察组手术前后血清lincRNA-ROR相对表达量分别为1.88±0.74、1.01±0.52，对照组为1.31±0.62，两两比较P<0.05或<0.01。乳腺癌组织lincRNA-ROR相对表达量为2.19±0.97，癌旁正常组织为0.79±0.35，二者比较P<0.01。血清lincRNA-ROR诊断早期乳腺癌的曲线下面积(AUC)大于CA153和CEA，敏感性及特异性均高于CA153和CEA；血清lincRNA-ROR、CA153、CEA联合检测诊断早期乳腺癌的AUC均大于上述指标单独检测，敏感性及特异性均高于上述指标单独检测。结论乳腺癌患者血清和癌组织中lincRNA-ROR表达均升高；血清lincRNA-ROR表达检测有助于乳腺癌的早期诊断及疗效判断。

乳腺癌；长链非编码RNA-ROR；糖类抗原153；癌胚抗原；早期诊断

长链非编码RNA(lincRNA)在肿瘤的发生、发展、侵袭、转移中具有重要调节作用，是可用于肿瘤诊断和预后判断的分子标志物[1，2]。lincRNA-ROR对于多能干细胞的诱导分化具有重要作用[2]，是一个新的上皮-间质细胞转换诱导因子，能诱导乳腺上皮细胞发挥干细胞样作用，并促进乳腺癌的转移[3]。目前，关于lincRNA-ROR在乳腺癌组织、外周血中的表达变化及其能否可以作为乳腺癌早期诊断标志物的研究报道较少。本研究观察了乳腺癌患者血清和癌组织中lincRNA-ROR的表达变化，旨在为乳腺癌的早期筛查及疗效判断提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年1～12月于四川省肿瘤医院行手术切除治疗的乳腺癌患者120例(观察组)，年龄22～70(47.92±11.11)岁；病理类型：乳腺浸润导管癌105例、导管内癌7例、非特殊类型浸润性乳腺癌3例、黏液癌5例；乳腺癌早期(肿瘤直径<3 cm，同侧腋窝无淋巴结转移，无远处转移)55例，中晚期65例。纳入标准：①汉族；②女性；③初次诊断且未接受任何手术治疗、放疗、化疗及免疫治疗；④经术后病理诊断确诊为乳腺癌。排除标准：①伴其他恶性疾病；②伴急性疾病或急性创伤；③无法耐受手术。选取同期体检健康者90例(对照组)，均为女性，年龄(48.44±4.36)岁。两组年龄具有可比性。本研究通过医院伦理委员会审核，患者及家属均知情同意。

1.2 标本处理 收集空腹静脉血(5 mL)于分离胶/二氧化硅真空采血管(美国BD公司)中，37 ℃水浴30 min，3 000 r/min离心10 min，分离血清并保存备用。收集观察组手术切除的新鲜癌组织及其配对癌旁正常组织(距肿瘤组织>5 cm)各24例份，迅速放入液氮中冷冻，-80 ℃保存备用。

1.3 血清及乳腺组织lincRNA-ROR表达检测 采用实时荧光定量PCR法。按照试剂盒说明，分别采用Bioteke法和TRIzol法提取两组血清及观察组乳腺组织中的总RNA，gDNA Eraser去除基因组DNA，紫外分光光度计(UV-2450，日本岛津公司)检测提取RNA的纯度，A260/A280为1.8～2.0视为合格样品，用于后续实验；采用琼脂糖凝胶电泳检测血清和乳腺组织中RNA均完整(电泳条带清晰，28 S/18 S条带亮度比值约为2∶1)。采用PrimeScriptTMRTⅡ逆转录试剂盒(宝生物工程大连有限公司)行逆转录获得cDNA，-80 ℃保存备用。逆转录条件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃、60 s。参考文献[4]设计引物，以β-actin作为内参，经BLAST比对后由上海生工生物工程有限公司合成。lincRNA-ROR：上游引物：5′- CCAGGACAATGAAACCAC -3′，下游引物：5′-AGGAGCCCAAAGTAACAG-3′，产物长度1 592 bp；β-actin：上游引物：5′-GAGCACAGAGCCTCGCCTTT-3′，下游引物：5′-ATCCTTCTGACCCATGCCCA-3′，产物长度129 bp。应用实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)检测每个扩增循环后SYBR®Green荧光信号水平。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s； 95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算lincRNA-ROR相对表达量。

1.4 血清lincRNA-ROR、糖类抗原153(CA153)和癌胚抗原(CEA)单独或联合检测对早期乳腺癌的诊断效能 采用雅培i4000全自动化学发光微粒子免疫分析仪，以电化学发光免疫分析法检测观察组早期乳腺癌患者术前与对照组血清CEA和CA153表达水平，严格按照血清CA153和CEA试剂盒(美国Abbott公司)说明书操作。绘制血清lincRNA-ROR、CA153、CEA单独或联合检测诊断早期乳腺癌的受试者工作特征(ROC)曲线，计算曲线下面积(AUC)、敏感性及特异性。

2 结果

2.1 血清及乳腺组织lincRNA-ROR表达 观察组手术前后血清lincRNA-ROR相对表达量分别为1.88±0.74、1.01±0.52，对照组为1.31±0.62，两两比较P<0.05或<0.01。观察组癌组织lincRNA-ROR相对表达量为2.19±0.97，癌旁正常组织为0.79±0.35，二者比较P<0.01。

2.2 血清lincRNA-ROR、CA153、CEA单独及联合检测对早期乳腺癌的诊断价值 观察组早期乳腺癌患者术前与对照组血清lincRNA-ROR相对表达量分别为1.66±0.69、1.31±0.62，血清CA153水平分别为(17.02±8.64)、(13.24±4.51)U/mL；二者比较P均<0.05。观察组早期乳腺癌患者术前与对照组血清CEA水平分别为(13.18±5.55)、(12.22±3.51)ng/mL；二者比较P>0.05。血清lincRNA-ROR诊断早期乳腺癌的AUC均大于CA153和CEA，敏感性及特异性均高于CA153和CEA；血清lincRNA-ROR、CA153、CEA联合检测诊断早期乳腺癌的AUC均大于上述指标单独检测，敏感性及特异性均高于上述指标单独检测。见表1。

表1 血清lincRNA-ROR、CA153、CEA单独或联合检测对早期乳腺癌的诊断价值

3 讨论

lincRNA可在表观遗传学、转录及转录后水平等多个层面上调控基因表达，其异常表达与肿瘤的生长、增殖、侵袭、播散、迁移及预后相关[5,6]。研究显示，lincRNA-ROR参与细胞生长发育、分化代谢等多种生物学功能的调节，在癌症进程中发挥癌基因或抑癌基因的生物学特性[7]，在肝癌[8]、胰腺癌[9]、膀胱癌[10]、乳腺癌[3]组织及其细胞系中异常高表达，而在胶质瘤组织和细胞系中低表达[11]。Hou等[3]研究发现，lincRNA-ROR表达与乳腺癌的病情有关，沉默lincRNA-ROR可抑制肿瘤生长和癌细胞转移，并通过调控miR-205、miR-145等影响细胞分化、侵袭、转移、凋亡等[12]。

核酸可稳定表达于人体外周循环系统中，以microRNA为代表的循环核酸可作为乳腺癌较新的诊断标志物[13]。研究发现，外周血中的长链非编码基因HOTAIR表达水平可动态监测乳腺癌患者体内肿瘤情况，其高表达可作为乳腺癌转移和患者死亡的独立预测指标[14]。lincRNA-ROR可通过沉默miR-34a的表达抑制吉西他滨诱导的乳腺癌细胞自噬和凋亡；lincRNA-ROR表达上调可导致乳腺癌化疗耐受，是乳腺癌多重耐药的一个标志物。本研究观察组癌组织lincRNA-ROR相对表达量明显高于癌旁正常组织，术前血清lincRNA-ROR相对表达量明显高于对照组；说明乳腺癌患者血清和癌组织中lincRNA-ROR表达均升高。本研究观察组术后lincRNA-ROR相对表达量明显低于术前，提示血清lincRNA-ROR表达可动态反映乳腺癌患者体内的肿瘤情况，血清lincRNA-ROR表达可用于手术效果评价和肿瘤复发监控，有助于指导临床个体化治疗。

CA153和CEA是传统乳腺癌筛查、诊断及预后监测的血清学指标[4]。但乳腺癌发病机制复杂多样，与多种基因调节异常和信号通路改变密切有关，而常规乳腺癌单一检测指标的诊断准确性有限，容易漏诊，临床上通常采用联合检测以提高诊断准确率。本研究结果显示，血清lincRNA-ROR诊断早期乳腺癌的AUC均大于CA153和CEA，敏感性及特异性均高于CA153和CEA，说明单项指标检测时血清lincRNA-ROR对早期乳腺癌的诊断价值较高；血清lincRNA-ROR、CA153、CEA联合检测诊断早期乳腺癌的AUC均大于上述指标单独检测，敏感性及特异性均高于上述指标单独检测，说明上述指标联合检测诊断早期乳腺癌的价值高于单独检测。以上均表明血清lincRNA-ROR可作为乳腺癌早期诊断的一个潜在分子标志物。

综上所述，乳腺癌患者血清和癌组织中lincRNA-ROR表达均升高，lincRNA-ROR表达检测有助于乳腺癌的早期诊断及疗效判断。lincRNA-ROR作为早期乳腺癌的一个新型分子标志物和治疗的潜在靶点，其临床价值仍待进一步探索。

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国家自然科学基金面上项目(81372945)。

张遵真(E-mail： zhangzunzhen@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.32.025

R737.9

B

1002-266X(2017)32-0078-03

2016-09-30)