白叶茶鲜叶制益生茶的急性、慢性毒性试验研究

孙凯，黎顺庚，王光光，范文桐，王玲，卞建春*

（1.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009；

2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009；3.江苏溧阳市天目湖龙鑫特色农机专业合作社，江苏溧阳 213334）

白叶茶鲜叶制益生茶的急性、慢性毒性试验研究

孙凯1，2，黎顺庚3，王光光1，2，范文桐1，2，王玲1，2，卞建春1，2*

（1.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009；

2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009；3.江苏溧阳市天目湖龙鑫特色农机专业合作社，江苏溧阳 213334）

为了探明白叶茶鲜叶制益生茶作为保健茶的毒理学安全性，以不同浓度的益生茶为原料，对SD大鼠同时进行急性和慢性毒性试验。急性毒性试验，清洁级SD大鼠随机分为对照组和试验组，试验组每天以5 mL/kg·BW浓度5%益生茶液灌胃，对照组灌服等量生理盐水，试验期为14 d，观察相关生理体征变化。慢性毒性试验，清洁级SD大鼠随机分为对照组和益生茶高、中、低剂量组共四组，益生茶对应各组自由饮用浓度分别为3%、2%和1%的茶液，对照组自由饮用蒸馏水，试验期6周，试验结束后，检测各组大鼠血液学和血液生化学指标及脏器系数变化。经口急性毒性试验中，益生茶对SD大鼠的食物利用率和生理体征无显著影响（P〉0.05）。慢性毒性试验中，益生茶各剂量组SD大鼠的体重、血液学、血液生化学指标值及各脏器的脏/体比值与对照组比较均无显著性差异（P〉0.05）。益生茶各组大鼠主要脏器在外观形态和组织学上均无异常变化。在本试验条件下，未发现明显毒性反应和病理变化，表明白叶茶鲜叶制益生茶对雄性大鼠基本无毒。

白叶茶鲜叶；益生茶；SD大鼠；急性毒性；慢性毒性

Abstract：In order to explore the toxicological safety of probiotic tea made from fresh albino tea leaves as raw materials for health care tea，the acute and chronic toxicity tests were carried out on SD rats with different concentrations of probiotic tea.In the acute toxicity test，clean SD rats were randomly divided into the control group and the experimental group.The test group was fed with 5% （wt%）probiotics 5 mL/kg·BW per day，and the control group was fed with the same amount of normal saline.After 14 days trial period，the changes related to physiological signs were observed.In the chronic toxicity test，the SD rats were randomly divided into the control group and other three groups with high， middle and low doses of probiotics tea.The concentration of probiotics tea drink in the high，medium and low dose groups was 3%，2%and 1%，respectively.The control group was free to drink distilled water.

Keywords：Fresh albino tea leaves； Probiotic tea； SD rat； Acute toxicity； Chronic toxicityAfter 6 weeks trial period， the hematology， blood biochemical indicators and changes in the organ coefficient were detected.Results： In the oral acute toxicity test， probiotic tea had no effect on the food utilization and physical signs of SD rats（P〉 0.05）.In the chronic toxicity test， the body weight， hematology， blood biochemical indexes and the ratio of viscera to body of SD rats in each dose group were not significantly different from those in the control group （P〉 0.05）.There were no abnormal changes in the appearance and histology of the rat's main organs in each group.Under the experimental conditions，no obvious toxic reaction and pathological changes were observed.And the results showed that probiotic tea made from fresh albino tea leaves was almost nontoxic to male rats.

采用白叶1号茶鲜叶为原料而制备的龙鑫益生茶（以下简称益生茶），是在传统茶生产工艺基础上，通过现代分子标靶、益生菌分离、高通量分子筛选等高科技技术，将益生菌与优良白叶茶鲜叶有机嫁接，经特殊工艺深度发酵，精制而成。黑茶在减肥降脂[1-3]、调节脂质代谢[4]、抗氧化[5]等方面具有卓越功效。黑茶种类众多、历史悠久，随着市场对黑茶的需求不断升温，黑茶的饮用安全性问题也有必要引起足够的重视。据报道，各种黑茶的常规成分咖啡碱、茶多酚等都有明确的生物学毒性[6-8]。刘勤晋等[9]对普洱茶急性毒性进行了安全性评价，认为茶叶中过高浓度的咖啡碱和茶多酚可导致小鼠死亡，科学的饮茶法是饮茶健身的必然要求。目前，还没有关于白叶茶鲜叶制益生茶的毒性研究的报道，为了证明白叶茶鲜叶制益生茶饮用的安全性，本试验以龙鑫益生茶为材料，进行了白叶茶鲜叶制益生茶的急性、慢性毒性试验研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验材料

清洁级 SD大鼠：雄性，体重80～100 g，由江苏大学实验动物中心（许可证号SCXK（苏）2013-0011）提供。饲养环境为室温22±2℃，相对湿度60±10%，自然光照，自由饮水和采食。

白叶茶鲜叶制益生茶：市售一级龙鑫益生茶。

电子天平（Sartorius，Germany）、全自动生化分析仪（AU480，Beckman Coulter USA）、血常规分析仪（DC-2800-VET，迈瑞）。

1.2 试验方法

1.2.1 茶汤配制

参考相关文献[10]，按5 g∶100 mL比例用蒸馏水配制相关茶汤 （相当于体重60 kg的成人每天饮用5 g的益生茶），85℃以上水温浸泡30 min后纱布过滤，即得灌胃剂量，作为急性经口毒性试验最高剂量。同时称取10 g、20 g和30 g益生茶分别加入蒸馏水1000 mL，85℃以上水温浸泡30 min后纱布过滤得1%、2%与3%茶水，作为慢性毒性试验实验组剂量。

1.2.2 急性经口毒性试验

清洁级SD大鼠12只，适应饲喂2周后随机分成2组，每组6只。试验组大鼠均按5 mL/kg·BW 每日1次经口灌胃5 g∶100 mL[9]的益生茶汤，对照组灌服等量生理盐水。灌胃前12 h禁食，不禁水。试验期14 d，每天观察动物的进食、活动、毛发、粪便等行为学活动情况，记录每日摄食量。每周称重1次，并依据5 mL/kg·BW的5%益生茶汤灌胃剂量调整体重变化大鼠的灌胃量。记录动物毒性反应情况和死亡动物分布。动物死亡后及时进行尸检，若肉眼观察异常时则进行病理检查。

1.2.3 慢性毒性试验

SD大鼠24只，适应饲喂2周后，称起始体重为250.4±6.5 g，参照农药登记毒理学试验方法（GB 15670-1995）[11]将大鼠随机分成 4组，每组6只，设置蒸馏水空白对照组、1%茶水组、2%茶水组、3%茶水组（组别编号依次为1～4），各剂量组茶水试制方法同急性试验组，采用自由饮用法给予受试物。试验期为6周，每周称重1次。实验期末禁食12 h，摘眼球取血进行血液学和血液生化检查。检测的血液学指标包括白细胞数目（WBC）、淋巴细胞数目（Lymph）、红细胞总数（RBC）、血红蛋白（HGB）、平均红细胞（MCV）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、单核细胞数目（Mon）；检测的血液生化指标包括血清天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、谷氨酰氨转移酶（GGT）、尿素氮（BUN）、总蛋白（TP）、总胆红素（T-BIL）、肌酸激酶（CK）等。 将大鼠用断头法处死，解剖大鼠后肉眼检查各器官情况，取心、肝、脾、肺、肾称重，并计算各脏器系数。

周二的班级群，既是班级工作的“吐槽大会”，又是表扬大会，在各方的批评和表扬中，形成班级的治班锦囊。有一次，几位家长反映英语课堂纪律差。事后我了解到，原来那段时间学校的助教没安排过来，英语老师又是外教，加上学生多、自控力差，班级纪律便较差。在群里说明问题后，峻熙妈妈主动提出来学校担任助教工作，因为她英语过了八级，还当过老师，应该能胜任。于是，我向学校申请，那段时间就由我们班家长暂担助教工作。后来，英语课堂纪律果真有了极大改善，家长们纷纷点赞，希望自己也能进课堂。在吐槽和表扬中，我们共同为孩子的成长护航。

1.2.4 统计学分析

试验数据以平均值±标准偏差的形式给出，采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析（One Way ANOVA），选择多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法统计；若方差不齐，则选用非参数分析。P〈0.05表明差异有显著统计学意义。

2 结果与分析

2.1 急性经口毒性试验

2.1.1 一般临床观察结果

经过14 d的观察，全部动物活动良好，无任何中毒症状，无死亡，说明雄性大鼠经口灌服益生茶的 LD50〉5 g ∶100 mL。

2.1.2 对大鼠摄食量的影响

试验期间，试验组大鼠采食量正常，与对照组相比无显著性差异（P〉0.05），如表1所示。结果表明益生茶对雄性大鼠摄食量无明显影响。

表1 益生茶对大鼠摄食量影响Table 1 Effects of Probiotic tea on food intake in rats

2.1.3 对大鼠体重的影响

试验期间，试验组大鼠体重的正常，与对照组比较无显著性差异（P〉0.05），如表2所示。结果表明益生茶对雄性大鼠体重增长无明显影响。

表2 益生茶对大鼠体重的影响Table 2 Effects of Probiotic tea on body weight in rats

2.1.4 解剖观察主要脏器

试验结束断头法处死大鼠后解剖，肉眼观察试验组和对照组大鼠均未发现脏器出现体积、颜色、质地等异常改变。试验未对大鼠血液生化、脏器、病理学组织开展进一步研究。

2.2 慢性毒性试验

2.2.1 一般指标

益生茶各剂量组及空白组大鼠在6周试验期内活动、饮食、大便和皮毛光泽等情况未见异常症状。处死动物，剖取各组大鼠的心、肝、脾、肺、肾等脏器，首先做肉眼观察，发现脏器外形、体积、色泽均属正常，无充血、肿胀和坏死等异常表现。

2.2.2 对大鼠体重的影响

益生茶对大鼠体重的影响见表3。与对照组比较，试验组大鼠体重增长正常，体重变化无明显差异（P〉0.05），表明大鼠长期饮用益生茶对雄性大鼠食物利用率无影响。

2.2.3 对大鼠脏器系数的影响

益生茶对大鼠脏器系数的影响见表4。与对照组相比，饮用益生茶高中低剂量组大鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要脏器系数均无明显差异（P〉0.05），表明大鼠长期饮用白茶鲜叶制益生茶对雄性大鼠主要脏器重量无明显影响。

表3 制益生茶对大鼠体重的影响Table 3 Effects of Probiotic tea on body weight in rats

表4 益生茶对大鼠脏器系数的影响Table 4 Effects of Probiotic tea on organ coefficient in rats

2.2.4 对大鼠血液学指标的影响

益生茶对大鼠血液学指标的影响结果见表5。与对照组相比，自由饮用益生茶高、中、低剂量组大鼠血液的白细胞数目 （WBC），淋巴细胞数目（Lymph），红细胞总数（RBC），血红蛋白（HGB），平均红细胞压积（MCV），平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC），单核细胞数目（Mon）等指标均无显著差异（P〉0.05），表明益生茶对雄性大鼠血液学指标无明显影响。

表5 益生茶对大鼠血液学指标的影响Table 5 Effects of probiotic tea on hematological indicators in rats

2.2.5 对大鼠血液生化学指标的影响

益生茶对大鼠血液生化学指标的影响结果见表6。与对照组比较，自由饮用益生茶汤高、中、低剂量组大鼠血液的天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶 （ALT）、谷氨酰氨转移酶（GGT）、尿素氮（BUN）、总蛋白（TP）、总胆红素（TBIL）、肌酸激酶（CK）的检查结果均无显著差异（P〉0.05），揭示益生茶对雄性大鼠肝、肾功能无明显影响。

表6 益生茶对大鼠血液生化学指标的影响Table 6 Effects of Probiotic tea on blood biochemical indexes in rats

3 讨论

试验以白叶茶鲜叶制益生茶为受试物进行了急性经口灌胃和慢性毒性试验，以期了解短时间和较长时间白叶茶鲜叶制益生茶所产生的毒性反应和发挥毒性作用的靶器官。从急性毒性试验来看，大鼠经口灌胃5 mL/kg·BW的5%益生茶汤14 d后未观察到大鼠有明显中毒体征，体重增长情况与对照组相比无明显差异（P〉0.05），无动物死亡，试验结束解剖动物，肉眼观察试验组和对照组主要脏器的体积、颜色、质地未出现异常，故未进一步进行病理检查。通过急性毒性试验可以看出益生茶基本无急性毒性，因此饮用正规渠道的益生茶具有很高的安全性，但是饮用任何物质超过一定范围都可能致死，大鼠经口灌服蒸馏水的LD50为 469±51 mL/kg[12]，因此科学地饮用益生茶才是饮茶健身的必然要求。

从慢性毒性试验来看，经过6周大鼠连续自由饮用益生茶汤后，解剖观察大鼠主要脏器未见异常，且作为显示受试物靶器官重要指标的脏器系数[13-14]与对照组相比也无显著性差异，血常规和生化检查与蒸馏水对照相比均无明显差异 （P〉0.05），说明益生茶对大鼠的生长发育、肝肾功能、器官组织均无明显毒性。综上所述，急性经口毒性试验显示白叶茶鲜叶制益生茶无急性毒副作用，慢性毒性实验显示白叶茶鲜叶制益生茶长期使用是安全的。白叶茶鲜叶制益生茶对大鼠基本无毒性，作为保健性饮品的开发利用是安全的。后续将对白叶茶鲜叶制益生茶的保健功效进行进一步研究，以期了解白叶茶鲜叶制益生茶在抗氧化、减肥降脂方面的功效。

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浙江省茶资源跨界应用技术重点实验室

浙江省茶资源跨界应用技术重点实验室是经浙江省科学技术厅、浙江省财政厅和浙江省发展和改革委员会联合发文（浙科发条【2013】165号）批准建设的重点实验室，挂靠单位为中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院。实验室2013年7月正式批复建设，2016年1月顺利通过验收。2014～2016浙江省科技厅组织的绩效评价中，结果为优秀。

重点实验室针对茶叶资源生态高值利用和跨界含茶终端产品开发不足的问题，重点围绕以下几个方向的科技创新和成果孵化工作：（1）茶资源功能活性物质制备与改性技术研究；（2）功能性终端茶制品开发与品控技术研究；（3）茶资源高效利用关键设备开发与应用技术研究；（4）终端产品功能、安全评价及标准化研究。

联系人：周春江 电话：0571-86040643,15868115470

Acute and Chronic Toxicity Test of Probiotic Tea Produced by Fresh Albino Tea Leaves

SUN Kai1，2， LI Shun-geng3， WANG Guang-guang1，2， FAN Wen-tong1，2， WANG Ling1，2，BIAN Jian-chun1，2*
（ 1.College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China； 2.Jiangsu Co-Innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses，Yangzhou 225009， China；3.Jiangsu Liyang Tianmuhu Longxin Featured Agricultural Cooperatives， Liyang 213334， China ）

TS272.5+5；R994.4

A

2095-0306（2017）02-0011-05

2017-04-03

江苏省溧阳市重点研发计划-现代农业（LB2015005）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）

孙凯（1993-），男，江苏徐州人，硕士研究生，主要从事动物营养代谢病与中毒病研究。

*

jcbian@yzu.edu.cn