河南省维生素D受体基因rs2222570和rs731236位点多态性与结核病的易感性*

石 洁，朱岩昆，郑丹薇，马晓光，王少华，李 辉，邢 进，吴彩霞

河南省疾病预防控制中心 郑州 450016

河南省维生素D受体基因rs2222570和rs731236位点多态性与结核病的易感性*

石 洁，朱岩昆，郑丹薇，马晓光，王少华，李 辉，邢 进#，吴彩霞

河南省疾病预防控制中心 郑州 450016

结核病；维生素D受体基因；单核苷酸多态性；多因子降维法

目的：探讨河南省人群维生素D受体(VDR)基因多态性和结核病易感性之间关系。方法采用病例对照研究方法，病例组纳入260个结核病患者，并以年龄和性别相匹配纳入260名健康人作为对照组。采用PCR-SSCP法对VDR基因位点多态性进行分析。应用SPSS 19.0对数据进行统计分析，SHEsis在线分析2个位点单倍体型和结核病发病的关联，MDR软件3.0.2分析基因和环境交互作用对结核病发病的影响。结果VDR基因rs2222570位点多态性与结核病发病风险相关，野生型C/C降低了结核病发病50%的风险(校正OR=0.501，95%CI：0.343～0.709)，并且该位点等位基因C在对照组中高于病例组(校正OR=0.632, 95%CI: 0.493～0.868)；而VDR基因的rs731236位点突变基因型C/C增加结核病发病风险(校正OR=2.001, 95%CI: 1.838～2.191)。VDR基因单倍体型CT、TT和TC与结核病发病相关[CT：OR(95%CI)=0.673(0.521～0.847)，P<0.001；TT：OR(95%CI)=1.332(1.043～1.711)，P=0.032；TC：OR(95%CI)=6.561(2.366～18.143)，P<0.001]。MDR结果表明VDR 基因rs2222570和rs731236位点多态性、吸烟、结核病患者密切接触史4个因素交互作用增加了结核病发病风险[OR(95%CI)=7.619(2.201～26.354)，P<0.001]。结论VDR基因多态性与结核病发病风险相关，且VDR 基因rs2222570和rs731236位点多态性、吸烟、结核病患者密切接触史存在交互作用。

中国作为结核病高负担国家，每年有100万人发病。尽管结核病是一种高度传染性疾病，但结核菌携带者中只有1/10的人发病[1]，结核分枝杆菌的感染、结核病发生和转归与环境因素及宿主遗传因素密切相关[2]，且这些因素之间存在复杂的交互作用。目前已有学者对结核病候选基因多态性尤其是维生素D受体(VDR)基因与结核病的关系展开了系列研究：维生素D作为一种重要免疫调节激素[3]，其活性代谢物1,25-二羟基维生素D3参与了单核细胞的激活，刺激细胞介导的免疫，从而抑制淋巴细胞增殖、免疫球蛋白产生及细胞因子合成[4]。VDR位于单核细胞表面，通过激活T淋巴细胞和B淋巴细胞，介导了维生素D3功能的发挥[5]。VDR为一种配体结合的转录因子，与维生素D3相结合，通过作用于维生素D反应元件和上游靶基因改变了其转录活性[6]。VDR编码基因存在单核苷酸位点多态性，且大部分位点可通过限制性酶切位点来鉴定，比如内含子8上的T到G突变形成的BsmⅠ和ApaⅠ位点，外显子9上的T到C沉默突变形成的TaqⅠ位点，以及导致蛋白功能缺失的C到T突变形成的FokⅠ位点。

作者的前期研究[7]结果表明VDR基因多态性与结核病的关系因研究对象不同而存在分歧，并且河南地区该基因多态性对结核病发病的影响目前尚未见报道。为此该研究对VDR基因rs2222570位点和rs731236位点多态性与河南省结核病的易感性进行研究，以期为河南省预防控制该病的发生和流行提供科学依据。

1 对象与方法

1.1研究对象该研究依照《中国结核病防治规划实施工作指南》诊断标准，共收集2015年新确诊结核病涂片阳性的肺结核病患者260 例(病例组)，排除合并有HIV 感染、糖尿病、肿瘤、慢性肺炎等其他疾病患者。对照组260例，为同期健康体检的健康人群，胸透无异常，PPD 试验排除结核杆菌感染，其他疾病的排除标准同病例组，且年龄、性别构成与病例组匹配。研究对象均签署知情同意书。

1.2问卷调查和样本采集参照相关文献[2]，选择与结核病发生相关因素作为主要调查因素，包括一般信息、生活居住环境、饮食行为习惯、结核病接触史、卡介苗接种史等。抽提研究对象全血中基因组DNA用于后续研究。

1.3VDR基因型多态性检测采用PCR限制性酶切长度片段多态性方法对VDR基因rs2222570位点和rs731236位点进行单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)分型检测。PCR热启动反应酶TaqHS订购于TaKaRa公司。PCR反应引物由上海生工生物工程有限公司进行合成，并将扩增产物送至该公司测序。引物序列见表1。

表1 VDR基因2个SNP位点的引物序列

取100 μL血标本，按照血液基因组提取试剂盒(Qiagen公司)说明书的步骤进行DNA抽提，最终DNA沉淀溶于100 μL TE中。以58 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s的PCR条件扩增目的片段。 为观察rs2222570位点和rs731236位点的多态性，将扩增成功的PCR产物分别用FokⅠ和TaqⅠ内切酶于37 ℃酶切反应4 h后进行琼脂糖电泳检测。

1.4统计学处理采用EpiData 3.1进行平行双录入，并进行逻辑纠错和一致性检验。用Excel 2003对统计后的基因型数据进行Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验。采用SPSS 19.0进行分析，应用两独立样本t检验和χ2检验比较2组人群的基本特征；应用χ2检验分析样本等位基因和基因型频率，计算比值比(odds ratio，OR)及95%置信区间(95%CI)。采用SHEsis在线软件进行单倍体型的预测、构建和分析。采用MDR 3.02软件对基因-环境交互作用进行多因子降维法分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1研究对象的一般情况因对照组中有2例样本基因组提取未能完成后续PCR和酶切检测，最终260例病例和258例对照纳入分析。研究对象的一般情况见表2，数据显示2组人群的年龄和性别构成相匹配(P>0.05)，可排除性别和年龄对其他危险因素的混杂作用。

表2 研究对象的年龄及性别构成比较 例(%)

2.2VDR基因多态性与肺结核易感性的关系

2.2.1 VDR基因多态性的检测 VDR基因rs2222570位点酶切后将产生突变型T/T(350、150、60 bp)，杂合型C/T(400、350、150、60 bp)，野生型C/C(410和150 bp)3种基因型(图1左)。而VDR基因rs731236位点酶切后将产生突变型T/T(200和100 bp)，杂合型C/T(300、200、100 bp)，野生型C/C(300 bp)3种基因型(图1右)。

左：rs2222570位点SNP位点的酶切结果(1～3：C/T，C/C，T/T 3种基因型酶切结果，M：DNA标记物100 bp DNA Ladder)；右：rs731236位点SNP位点的酶切结果(1～3：T/T，C/C， C/T 3种基因型酶切结果；M：DNA标记物100 bp DNA Ladder)。 图1 SNP位点的PCR和酶切结果

分别将2个位点3种基因型部分PCR产物进行测序分析，结果如图2所示，可见突变型和野生型均为单一峰形，而杂合型有重叠峰，因此进一步确定2个位点的3种基因型。

图2 SNP位点测序结果分析

2.2.2 VDR基因位点Hardy-Weinberg平衡检验 见表3。rs2222570位点的PCR产物经FokⅠ酶切后共检出C/C、C/T和T/T 3 种基因型，对照组rs2222570位点各种基因型的理论频数和调查频数一致，符合Hardy-Weinberg 平衡(χ2=3.523，P=0.062)。rs731236位点PCR产物经TaqⅠ酶切后共检出T/T、T/C和C/C 3 种基因型，对照组rs731236位点各种基因型的理论频数和调查频数一致，符合Hardy-Weinberg 平衡(χ2=1.201，P=0.268)。两个位点的P值均>0.05，说明该研究2个位点选择的样本具有群体代表性。

2.2.3 VDR基因多态性与结核病易感性关系 见表4、5。从表4可看出病例组中VDR基因rs2222570位点基因型C/C的分布频率低于对照组(P<0.001)。校正年龄、性别等因素后，以C/C为参照，杂合型和突变型OR值分别为1.933和2.241。结果表明基因型C/C为结核病患病的保护因素。而VDR基因rs731236位点基因型与结核病发病无关联性(P=0.072)。将基因型多态性转化进行遗传学模型，对其与结核病发病相关性进行分析。结果表明VDR基因位点基因型C/C和显性模型基因型(C/T+T/T)分布频率差异有统计学意义(χ2=14.102，P<0.001)，其OR值及95%CI为0.50(0.343～0.709)。并且与T等位基因相比， rs2222570位点C等位基因降低了结核易感性(OR=0.632，95%CI=0.493～0.868)，进一步表明在河南人群中该位点的野生基因型C/C和等位基因C是结核病发病的保护因素。而VDR基因rs731236位点基因型C/C和隐性模型基因型(T/C+T/T)分布频率差异有统计学意义(χ2=4.001，P=0.038) ，基因型C/C是河南省结核病发病的危险因素，OR值及95%CI为2.001(1.838～2.191)。

表3 VDR基因位点Hardy-Weinberg平衡检验

表4 VDR基因型和结核病发病风险关联分析

表5 VDR基因遗传学模型和结核病发病风险关联分析

2.2.4 VDR基因SNP 位点单倍体型与结核病易感性的关系 对VDR基因的2个SNP位点进行单倍体频率分析，2个SNP位点共产生4种单倍体型，其频率分布如表6所示。单倍体型CT在病例组中的分布小于对照组，为结核病发病的保护因素。而单倍体型TT和TC在病例组中的分布高于对照组，为结核病发病的危险因素。

表6 VDR 基因SNP 位点的单倍体型频率分布

2.3基因-环境交互作用分析将维生素D受体基因2个多态性位点以及和结核病发病相关的吸烟、饮酒、卡介苗接种、结核病人密切接触史、睡眠时间、粉尘接触等环境资料导入MDR软件，经拟合后获得了1-4阶不同交互情况下的最优模型。由表7可知所给模型差异均有统计学意义(P均<0.001)，4 阶模型的检验样本准确度和交叉检验一致性高其他模型，因此选择4 阶模型为最优模型，该最优模型包含了吸烟、VDR基因rs2222570位点、rs731236位点和结核病人密切接触史4个因素。

表7 1-4 阶基因-环境交互作用模型分析结果

X2：吸烟，X5：rs2222570位点，X7：结核病人密切接触史，X8：rs731236位点。

3 讨论

在罗伯特·科赫发现结核病病因前，医生就建议患者服用鱼肝油或者晒太阳获取维生素D治疗结核病[8]。许多研究[9-10]表明维生素D的缺失将增加结核病的发病风险。VDR基因遗传因子的改变将引起基因激活能力的缺陷，或者改变了VDR受体的蛋白结构，从而影响二羟维生素D的细胞学功能。有研究[11]表明，在不同人群中VDR基因TaqⅠ和FokⅠ位点的多态性和结核病易感性相关 。目前该位点多态性与结核病关系的结果因研究对象不同而存在分歧。

有研究[8]表明FokⅠ位点FF通过调节维生素D的免疫协调机制增加了VDR受体的表达。但Liu等[12]进行病例对照研究表明，结核病人与健康对照相比存在更高的ff基因频率。 而Bornman等[13]认为VDR受体FokⅠ位点 RFLP 与结核的发病没有相关性。作者的研究结果表明VDR基因rs2222570位点多态性与结核发病存在相关性，该位点显性基因C相对于隐性基因T是结核病的保护因素，OR值为0.632，因此隐性基因T作为结核病发病危险因素，使杂合型C/T和突变型T/T相对野生型C/C增加了结核病的发病风险，OR值分别为1.933和2.241。并且遗传学模型进一步表明该位点野生型是结核病发病的保护因素，其显性模型中C/C相对于其他2种基因型降低了结核病发病的易感性，OR值为0.501。因此结果提示VDR基因rs2222570位点多态性和结核病的发病相关，其野生型降低了结核病的发病风险。

Bellamy[14]研究表明VDR基因TaqⅠ位点tt基因型与TT和Tt相比降低了结核病发病风险(OR=0.53，95%CI：0.31～0.88)；反之，在印度结核病人的研究中发现TaqⅠ位点tt基因型增加了女性患者的发病风险[15]。近年来在巴拉圭的研究[16]表明TaqⅠ位点t等位基因保护了活动性肺结核的发生，而F位点降低了结核病的发病风险；VDR基因的多态性不仅影响了宿主对结核菌易感性，而且影响宿主对结核病预后；VDR的TT基因型与Tt相比，也明显缩短了结核菌痰培养阴转的时间。该研究结果表明虽然VDR基因rs731236位点基因型与结核病发病无关，但将其转化为遗传性模型后VDR基因rs731236位点基因型C/C和隐性模型基因型(T/C+T/T)分布频率差异有统计学意义，基因型C/C是河南省结核病发病的危险因素，OR值为2.001。

VDR基因的单倍体型，由于其不仅涵盖了调节基因表达mRNA启动子区和3’非翻译区，还涵盖了蛋白编码区域，因此更能表明反映蛋白功能及其与结核发病的相关性[17-19]。该研究中虽然rs731236位点的3种基因型在病例组和对照组间差异无统计学意义，但和rs2222570位点组合后，单倍体型CT在病例组中的分布小于对照组，为结核病发病的保护因素。而单倍体型TT和TC在病例组中的分布高于对照组，为结核病发病的危险因素。

作者对VDR基因rs2222570位点、rs731236位点和传统因素之间的交互作用进行分析，由于logistic 回归对交互作用的分析存在自身局限性，因此，该研究采用多因子降维法检测交互作用最优模型，能够更全面的评价VDR基因对传统环境因素交互作用。MDR结果显示的最优模型包含了吸烟、VDR基因rs2222570位点、rs731236位点和结核病人密切接触史4个因素。该结果与苏倩等[20]对重庆地区人群研究显示的FokⅠ-ff基因型、吸烟及结核病患者接触史在结核病发生中存在交互作用相一致。

总之，该研究探讨VDR基因多态性与传统因素交互作用对河南省结核易感性影响，表明VDR 基因rs2222570位点基因型C/C是结核病发病的保护因素，rs731236位点基因型C/C是结核病发病的危险因素，并且多因子降维分析表明二者和吸烟及结核病患者密切接触有协同作用。但该研究仅仅对VDR基因2个位点及传统因素交互作用对结核易感性的影响进行分析，今后还应纳入VDR基因的其他多态性位点进行分析，并对多个位点连锁不平衡进行分析，以及对VDR基因多态性与结核病转归关系进行研究。

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(2016-11-07收稿 责任编辑赵秋民)

Association of polymorphisms of rs2222570 and rs731236 in vitamin D receptor gene with tuberculosis susceptibility in Henan Province

SHIJie,ZHUYankun,ZHENGDanwei,MAXiaoguang,WANGShaohua,LIHui,XINGJin,WUCaixia

HenanProvinceCenterforDiseaseControlandPrevention，Zhengzhou450016

tuberculosis；vitamin D receptor gene；single nucleotide polymorphisms；multifactor dimensionality reduction

Aim: To evaluate whether the vitamin D receptor(VDR) gene polymorphism or its haplotypes might be associated with tuberculosis susceptibility in Henan Han population. Methods: A total of 260 patients with tuberculosis were recruited, and 260 healthy control matched by sex and age were chosen. Genetic polymorphisms of rs2222570 and rs731236 in VDR gene were analyzed using PCR-SSCP. The data were analyzed by SPSS 19.0. The comparison of haplotypes were carried out by SHEsis online．The MDR 3.0.2 software was applied to analyze gene-environment interaction on the risk of tuberculosis susceptibility. Results: The variant genotypes of rs2222570 in VDR gene were significantly associ ated with the risk of tuberculosis, and the risk of individuals carrying wildtype genotype C/C decreased by 50%(adjustedOR=0.501，95%CI：0.343-0.709). The frequency of allele C in rs2222570 locus was significantly higher in control group compared with the tuberculosis group(adjustedOR=0.632, 95%CI:0.493-0.868). Whereas the mutant genotype C/C of VDR gene rs731236 polymorphism increased the risk of tuberculosis(adjustedOR=2.001, 95%CI:1.838-2.191)．Haplotype analysis showed significant differences in the frequency of haplotype CT，TT，and TC between the two groups[CT:OR(95%CI)=0.673(0.521-0.847),P<0.001; TT:OR(95%CI)=1.332(1.043-1.711),P=0.032;TC:OR(95%CI)=6.561(2.366-18.143),P<0.001]. The interaction of the four factor model, rs2222570，rs731236 of VDR genotypes polymorphisms，smoking and the history of exposure to tuberculosis, might increase the risk of tuberculosis [OR(95%CI)=7.619(2.201-26.354),P<0.001]. Conclusion: The polymorphism of rs2222570 and rs731236 in VDR gene are associated with the risk of tuberculosis, and there may be significant interaction between the rs2222570，rs731236 of VDR genotypes polymorphisms，smoking and history of exposure to tuberculosis.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.009

R183.3；R521

#通信作者，女，1966年6月生，硕士，主任医师，研究方向：结核病防控，E-mail：hncdcxj@163.com

*“十二·五”科技重大专项课题 2014ZX10003002；河南省卫生计生委普通科技攻关项目 201702277