基于微通道传感器的牛奶体细胞定量检测方法研究

张晓晨++龚瑞昆++崔传金

体细胞数（SCC）是指每毫升牛奶中含有的细胞总数，它是衡量新鲜的牛奶质量及奶牛乳房健康的重要指标之一。当奶牛乳房感染时，体细胞数会明显增加，奶牛的产奶量会降低，并且牛奶中含有致病菌的风险增大，影响人类健康。体细胞数做为衡量牛奶质量的关键指标，世界各国对体细胞数制定了严格的标准，其中新西兰的标准最为严格，为SCC≤40万/mL。我国发布了《中国农垦生鲜乳生产和质量标准》，第一次对体细胞数有了规定，为40万/mL。

检测体细胞含量的方法也多种多样。其中电化学阻抗法在细胞定量检测方面具有操作简便、成本低、能实现在线检测等优点，是一种极具优势的检测方法，特别是与微流控技术结合使这个方向成为一个新的研究热点。

本文使用微通道传感器，运用阻抗检测技术，研究了牛奶中细菌细胞的浓度。在未来阻抗检测技术会与新领域相结合，以达到更低的检测限，缩短检测时间，实现功能多样化。

试验研究

仪器与试剂。GamryReference 600电化学工作站、C1-20B离心机、XYF2-10-H超纯水机， thermo二氧化碳细胞培养箱，BHLM-M18无油真空泵，LDZX-30KBS压力蒸汽灭菌器，K562细胞株（中国科学院细胞库）。

细胞悬浮液的制备。将新鲜牛奶用真空泵过滤后，于室温下盛放于烧杯中备用。培养后的K562细胞按照计算好的比例分成六份，用离心机分离细胞，离心后去除上层清液。将细胞与定量的牛奶混合，制成20万，40万，80万，160万，320万，640万六个浓度的细胞悬浮液，放置在培养箱中等待检测。本实验所用器皿都经过高温灭菌处理。

阻抗的检测。微通道传感器的阻抗检测使用GamryReference 600電化学工作站完成，频率测试范围为10Hz-1MHz。测试前，用乙醇和超纯水清洗芯片，晾干使用。测试时用注射器将细胞悬浮液慢慢推送到微通道内，为了使测量到的阻抗更加准确，减小不利因素对检测的影响，每组浓度检测三次并取其平均值进行分析。在测量结束后立即丢弃检测样品，避免污染。

结果与分析

本实验，为了保证实验结果的准确性，尽可能排除其他因素对实验结果的影响，所有不同浓度的细胞均是现配现用。分别对20万/ml，40万/ml，80万/ml，160万/ml，320万/ml，640万/ml的牛奶溶液进行了测量，结果如图1所示。在低频率下，随着牛奶中细胞浓度的增大，阻抗逐渐增大，不同细胞浓度的牛奶有着良好的区分度。随着频率的逐渐增大，各浓度曲线渐渐重合，阻抗值的变化减小，无法很好地区分各浓度牛奶。综上所述，采用低频率测试较为合适。

测试的阻抗是电阻和电抗的矢量和，电抗由两部分组成，界面电抗和奶体的介质电抗。细胞悬浮在牛奶中，是奶体介质电容的主要阻抗部分。当细胞浓度大时，介质电容很大，对奶体的电抗起作用。但由于界面电抗远大于介质电抗，使界面电容充放电的时间更长，而介质电容的充放电时间短，使得电活性离子更容易在界面处堆积，从而使界面电容增大，而介质电容表现出较小值，进而影响牛奶中细胞浓度检测的检测限。因此，为了尽量减小界面电容的影响，提高电抗，本实验采用提高介质电阻的方法。增加了微通道的长度，减小了横截面积，从而增大了介质电阻。

在实际测量中，由于微通道内部的体积非常小，所以当细胞浓度为20万/mL和40万/mL时，理论上通道内的细胞个数应为6个和12个，相差非常小，再加上实际操作及环境等因素的影响，使得测量结果非常接近。在未来研究中，将会尝试进一步增大电抗的方法，以期获得更大的阻抗改变。endprint