北京地区某医院水痘带状疱疹病毒基因型的测定

2017-09-29夏天保刘建军刘军连吕世超

实用皮肤病学杂志 2017年4期

夏天保，冯凯，米霞，刘建军，刘军连，陈娓，吕世超

夏天保，冯凯，米霞，刘建军，刘军连，陈娓，吕世超

目的测定北京地区带状疱疹患者水痘带状疱疹病毒的基因型。方法采用测序的方法测定带状疱疹患者水痘-带状疱疹病毒ORF22、ORF38、ORF54基因序列。结果基因分析结果显示：北京地区306医院8株水痘带状疱疹病毒临床分离株中基因型均为J型，其中ORF22 序列中37990位点有1例存在A-G的突变。结论北京地区306医院的水痘带状疱疹病毒临床分离株中基因型均为J型，其中ORF22 序列中37990位点存在1例A-G的突变。

带状疱疹；水痘-带状疱疹病毒；泛昔洛韦；带状疱疹后遗神经痛；基因型

[J Pract Dermatol, 2017, 10(4):197-200]

水痘-带状疱疹病毒（VZV）是一种人类疱疹病毒，在幼儿通常引起水痘。原发感染后病毒潜伏终身，并经常在成年人或老年人引起带状疱疹。VZV基因组包含125 kb的线性双链DNA，包括一长一短独特的区域，每个两侧的反向重复序列[1]，和5个内部重复区域（R1～R5）已经确定。VZV基因组中至少含有71个开放阅读框（ORF），编码许多有功能的蛋白。Loparev 等[2]报道一个简单的分类方法，就是把野生型VZV菌株分成3个主要的亚型， E（欧洲），J（日本），和M（嵌合型），使用SNP识别ORF22读码框的447 bp的区域。Loparev 等[2]从最近的临床感染中得到的323株分布在全球各地的病毒株代表目前循环菌株（欧洲、亚洲、非洲、大洋洲和美洲），可以很容易地被分配到3个基因型中的一个。此外，从这一分析中每个基因型的区域特异性是显而易见的，这些数据揭示了主要基因型及其地理分布之间的进化关系。结果将有助于预测未来的进化模式和跟踪病毒流行病学的变化，这必然伴随着活跃的疫苗接种计划。

中国关于VZV分离株基因型的报道也逐渐增多，杨吉星等[3]2008年报道上海地区VZV的基因型是J型。马瑞等[4]2012年报道宁波市的15株VZV基因型中，J型13株，M1型2株，而北京地区的VZV分型文献较少。因此，笔者拟测定北京地区306医院带状疱疹患者VZV的基因型，对该院的12例水痘和带状疱疹患者的疱液进行检测和分析。

1 病例与方法

1.1 病例

1.1.1 临床资料选择2014年12月1日—2015年1月10日至解放军306医院就诊的水痘和带状疱疹患者，且能在水疱皮损中收集到疱液。共收集符合条件的患者12例，其中男8例，女4例；年龄18～75岁。均为汉族（无血缘关系），血常规、肝功能、血脂均正常。

1.1.2 入选标准 ①临床明确诊断的水痘或带状疱疹，患者的皮损时间为3 d以内；②年龄18～75岁；③性别不限。排除标准：①恶性肿瘤患者；②患有影响免疫功能的系统性疾病患者（甲亢或甲减或糖尿病）；③近期内应用过糖皮质激素或免疫抑制剂患者；④妊娠期和哺乳期妇女；⑤肾功能损害者；⑥人免疫缺陷病毒（HIV）阳性患者。所有入选患者均签署知情同意书，并经过医学伦理委员会同意。

1.2 实验方法

1.2.1 标本处理采集患者早期的疱液100 µl，置于-20℃低温冰箱保存待检。试剂仪器、全血直接聚合酶链反应（PCR）试剂盒、DNA Marker DL2000，琼脂糖、PCR管、凝胶成像系统，PCR VZV DNA，试剂和仪器由北京百奥森泰生物技术有限公司提供。

1.2.2 检测方法对ORF22读码框的447 bp的PCR目标区进行扩增，采用5 µl的DNA提取液（来自水痘或带状疱疹患者皮损的DNA提取液）。反应物：每20个碱基的引物100 pmol和2.5 U Taq DNA聚合酶（Applied Biosystems）。运行条件：95℃ 3 min, 95℃ 1 min，25个循环,50℃ 1 min，72℃ 3 min，72℃ 10 min。

1.2.3 PCR引物 ORF22引物：p22r1f（5 -GGG TTT TGT ATG AGC GTT GG-3 ；positions 37837 to 37856），反向引物 p22r1r（5 -CCC CCG AGG TTC GTA ATA TC-3；positions 38383 to 38356）被设计出来扩增出447 bp的片段（位置37837～38264）。ORF38引物：上游AAG TTT CAG CCA ACG TGC CAA TAA A，下游 AGA CGC GCT TAA CGG AAG TAA CG。ORF54引物：上游（F） CGT AAT GCA TAA CAG GCC AAC AC，下游 (R)GAA ACC TGG CGT CAA ACA TTA CA。

1.2.4 测序与分析 PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳（含EB）（Invitrogen）在紫外线下拍照。对分离的产物进行测序。测序的结果与GeneBank中VZV参考株Dumas进行序列比较，并分析其中的单核苷酸多态性，判断北京地区306医院VZV的基因型。

2 结果

2.1 琼脂糖凝胶水平电泳

PCR 产物 5 µl，6×Loading Buffer 1 µl混匀后加入泳道；Takara DNA Marker DL2000作为标准分子量对照； 5 V/cm电压电泳30 min。DNA marker DL 2000（TAKARA）作参照，紫外灯下观察结果并摄像（图1-3）（该DNA marker为DL 2000，分别为100、250、500、750、1 000、2 000 bp）。

2.2 经PCR对所有产物进行测序。

从临床采集的12份标本中经鉴定得到8株VZV临床分离株，病毒分离阳性率为66.7%。Loparev等[2]利用ORF22的 37902、38019、38055、38081、38177、38229位这6个位点的核苷酸序列的不同将VZV分为E、J、M 3个基因型。基因分析结果显示北京地区306医院8株VZV临床分离株中基因型均为J型，其中ORF22 序列中37990位点存在1例A-G的突变（表1，图4）。对北京市VZV分离株ORF38、 ORF54测序，结果发现其ORF38 Pstl+，ORF54Bgll+，而Dumas分离株ORF38 Pstl+，ORF54 Bgll-。

图1 水痘-带状疱疹病毒ORF22 PCR电泳图（PCR产物为418 bp）

图2 水痘-带状疱疹病毒ORF38 PCR电泳图（PCR产物为602 bp）

图3 水痘-带状疱疹病毒ORF54 PCR电泳图（PCR产物为468 bp）

表1 北京市VZV分离株ORF22的SNPs位点差异

3 讨论

图4 水痘带状疱疹病毒临床分离株ORF22 序列测序图

VZV基因组具有很好的遗传稳定性，在不同毒株间其基因组变异率仅为0.05%～0.06%，比人类其他疱疹病毒基因组变异率低5～10倍，这种情况给VZV的基因分型带来了巨大的挑战。Loparev等[2]报道一个简单的分类方法，就是把野生型VZV菌株分成3个主要的亚型，E（欧洲），J（日本），和M（嵌合型），使用SNP识别ORF22读码框的447 bp的区域，ORF22读码框这部分能够满足用于检测低滴度的临床标本和可靠地识别病毒DNA的3个主要基因型。无论是多个开放读码框的基因单核苷酸多态性分析和ORF22读码框的SNP分析，均能准确无误地解决VZV基因分型，在高度传代的欧洲和日本菌株，ORF22对于基因型的区域高度选择是稳定的。

在全球各地的VZV分离株中评价ORF38（PstI）和ORF54（BglI）单核苷酸多态性的分布。直接的测序分析是最准确的和最信息化的方法，它可识别单核苷酸多态性，单核苷酸多态性对病毒株的分类是有用的。Loparev等[2]采用这种方法在临床样本选定区域直接测序进行研究。在RFLP分析数据的基础上，对主要目标进行排序；最不同的模式被推定为准确地反映菌株的变化。该作者对全球各地的菌株进行了目标ORF测序，与已发表的ORF38 PstI位点和ORF54 BglI位点进行比较。

大多数在美国收集的VZV菌株参照欧洲的Dumas 菌株具有最大的整体相似性，同样所有日本的菌株与其他日本菌株表现出最大的相似性，而与Dumas和美国大多数菌株具有最大的不同。

本研究采用已经建立的SNP分析方法对VZV ORF22、38、54中的SNP位点进行了序列分析。依据Loparev的分类方法，将野生型VZV菌株分成3个主要的亚型， E（欧洲），J（日本），和M（嵌合型）。笔者从临床采集的12份标本中经鉴定得到8株VZV临床分离株，病毒分离阳性率为66.7%。基因分析结果显示北京地区8株水痘带状疱疹病毒临床分离株中基因型均为J型，其中ORF22 序列中37990位点存在1例A-G的突变。

Loparev等也证实了以前的报告[4,6]，大多数现代日本菌株的酶切位点有PstI +BglI+限制性酶切位点（检查的20株100%）。有趣的是，3种具有PstI - BglI+野生型菌株VZV 2002年在夏威夷被分离出来。所有的PstI / BglI基因分型同时进行RFLP分析和用FRET探针熔点进行分析，两种方法观察完全一致。对326份来自不同区域的菌株进行评估，这项研究证实了使用的LightCycler FRET分析方法来识别单核苷酸多态性是有效的。

306医院VZV基因分型的意义主要体现在水痘和带状疱疹的流行病学和疫苗研制方面。虽然北京地区现在水痘疫情已经大大减少，但有些区域偶有水痘暴发，且北京地区人口密集，外来人口较多，因此水痘暴发的原因很复杂且很难控制。而VZV的基因分型则可以帮助掌握VZV的流行病学特征，快速查明VZV毒株的来源，追踪VZV在好发人群的传播情况，切断传播的路线，及时控制疫情的发展及蔓延。为了更全面地掌握北京地区VZV基因型的分布，作者下一步应当扩大标本量，同时记录VZV患者的临床特征和相关的一些信息，深入探索VZV基因型与病毒感染和疫苗防疫之间以及和地理位置之间的关系。

[1] Takayama M, Takayama N. Long PCR amplification of varicella-zoster virus DNA in clinical specimens from the patients with varicella and herpes zoster [J]. Kansenshogaku Zasshi, 2002,76(5):347-354.

[2] Loparev VN, Gonzalez A, Deleon-Carnes M, et al. Global identification of three major genotypes of varicella-zoster virus:longitudinal clustering and strategies for genotyping [J]. J Virol,2004,78(15):8349-8358.

[3] 杨吉星, 居丽雯, 施强, 等. 上海地区水痘-带状疱疹病毒基因型研究 [J]. 中国卫生检验杂志, 2008, 2(18):223-224.

[4] LaRussa P, Lungu O, Hardy I, et al. Restriction fragment length polymorpHism of polymerase chain reaction products from vaccine and wild-type varicella-zoster virus isolates [J]. J Virol, 1992,66(2):1016-1020.

[5] 马瑞, 徐国章, 李翔, 等. 宁波市水痘-带状疱疹病毒株临床流行株基因分型 [J]. 中国公共卫生, 2012, 28(5):659-660.

[6] LaRussa P, Steinberg S, Arvin A, et al. Polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorpHism analysis of varicellazoster virus isolates from the United States and other parts of the world [J]. J Infect Dis, 1998, 178(Suppl 1):S64-S66.

（本文编辑耿建丽）

书讯

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Determination of varicella zoster virus genotype in a hospital in Beijing region

XIA Tian-bao，FENG Kai，MI Xia，et al
Department of Dermatology &Venereology,306th Hospital of PLA, Beijing 100101, China

Objective To detect the genotype of varicella zoster virus(VZV) genotype in 306 hospital in Beijing region.Methods VZV ORF22, ORF38, ORF54 gene sequence were detected by sequencing method. Results The results of gene analysis showed that the genotypes of the clinical isolates of 8 strains of VZV in Beijing region were J. There was a case of A-G mutation in the 37990 site of ORF22 fragement. Conclusion The genotype of the clinical isolates of VZV in 306 hospital in Beijing region was J. There was a case of A-G mutation in the 37990 site of ORF22 fragement.

Herpes zoster；Varicella zoster virus(VZV)； Famciclovir； Postherpetic neuralgia；Genotype

R752.12

1674-1293(2017)04-0197-04