急慢性再生障碍性贫血患者骨髓组织VEGF-C的表达及意义

江瑞，周妮，王琼，方杰，杨培仙

(中国人民解放军第105医院血液科，安徽合肥230031)

急慢性再生障碍性贫血患者骨髓组织VEGF-C的表达及意义

江瑞，周妮，王琼，方杰，杨培仙

(中国人民解放军第105医院血液科，安徽合肥230031)

目的探讨急慢性再生障碍性贫血(AA)患者骨髓血管内皮生长因子-C(VEGF-C)表达的异同及其意义。方法采用原位杂交法检测63例解放军第105医院2012年5月至2015年5月收治的急性和慢性AA患者免疫抑制剂与激素治疗前后骨髓小粒中VEGF-C的表达情况，其中急性AA 38例，慢性AA 25例，并与20例健康人作对照比较。结果VEGF-C主要表达于骨髓基质细胞，阳性表达率为20.63%。治疗后急慢性再生障碍性贫血患者骨髓血管内皮生长因子-C[(139.45±24.39)pg/mL、(134.78±25.24)pg/mL]的表达明显高于治疗前[(73.12±20.18)pg/mL、(66.23±21.86)p g/mL]，且低于对照组[(170.51±29.64)pg/mL]，差异有统计学意义(P＜0.05)。但急慢性再生障碍性贫血患者骨髓血管内皮生长因子-C(139.45±24.39)pg/mL、(134.78±25.24)pg/mL]比较差异无统计学意义(P＞0.05)。结论急慢性AA治疗前VEGF-C表达降低，治疗后VEGF-C表达上调，VEGF-C在疾病治疗转归中可起到重要作用。

再生障碍性贫血；急性；慢性；血管内皮生长因子-C；骨髓

再生障碍性贫血(aplastic anemia，AA)为获得性骨髓造血功能异常，主要由贫血、出血、感染引起，我国发病率高[1-2]。急性AA病程较长且病情进展迅速，死亡率高，慢性AA病程迁延，病情进展缓慢，生存期不等。治疗以免疫抑制或糖皮质激素为主，可缓解病情，临床具有一定的疗效，但部分患者效果差甚至死亡，且复发率高，AA的治疗成为临床难题[3-4]。血管内皮生长因子(VEGF)是高度特异的血管内皮细胞分裂原，可通过自分泌调节、加速骨髓造血，可诱导血管新生，维持血管密度和生理性造血[5-6]。VEGF-C作为骨髓组织促血管生成因子，其表达水平与骨髓基质损伤及恢复密切相关[7]。本研究采用原位杂交法检测急慢性骨髓VEGF-C表达，为AA开拓新的治疗途径，建立诊断及判断指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2012年5月至2015年5月解放军第105医院收治63例门诊及住院AA患者为研究对象，均经骨髓细胞学检查符合《血液病诊断及疗效标准》[8]，并排除心肝肾严重疾病。其中急性AA患者38例，男性23例，女性15例；年龄16～49岁，平均(34.2±5.6)岁。慢性AA患者25例，男性15例，女性10例；年龄13～49岁，平均(33.2±5.8)岁。选择同时期20例健康志愿者为对照组，其中男性12例，女性8例；年龄18～45岁，平均(35.1±6.2)岁。急性和慢性AA患者和健康志愿者的性别、年龄比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 治疗方法急性AA患者采用常规治疗，口服康力龙，2～4 mg/次，3次/d；静脉滴注兔抗人T细胞球蛋白3 mg·kg-1·d-1；口服环孢霉素软胶囊，5 mg·kg-1·d-1。慢性AA患者给予口服康力龙和环孢霉素软胶囊。3个月为一个疗程，共治疗2个疗程。

1.3 检测方法常规取髂后上棘骨髓0.3 mL，制成涂片标木送检，常规HE染色。采用原位杂交法检测VEGF-C，步骤为：切片置烤箱烘烤使切片紧密粘附；常规二甲苯脱蜡固定，和梯度酒精水化后；切片于，EDTA抗原修复液中进行抗原修复；过氧化氢溶液，阻断内源性过氧化物酶的活性；滴加BSA封闭液进行封闭；滴加兔抗人VEGF多克隆抗体；生物素化山羊抗兔IgG抗体；链霉亲和亲、素生物素-过氧化物酶复合物；DAB室温显色，并严格控制反应时间；复染后，脱水，透明，封片，进行观察。先在低倍镜下观察，阳性VEGF棕黄色者为阳性细胞阳性，表达部位在于细胞浆。随机选取5个视野，计数100个细胞，计算阳性细胞百分率。

1.4 统计学方法应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(x-±s)表示，组间比较行配对t检验；计数资料比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGF-C细胞表达VEGF-C阳性表达于骨髓基质细胞胞浆，呈棕黄色颗粒。血窦内皮周围细胞表达较高，造血细胞也可见表达。见图1、2、3。再生障碍性贫血VEGF-C主要表达于骨髓基质细胞。急慢性再生障碍性贫血VEGF阳性13例，阳性表达率为20.63%。

图1 VEGF-C治疗前急性AA骨髓组织表达(×200)

图2 VEGF-C治疗后急性AA骨髓组织表达(×200)

图3 VEGF-C正常骨髓组织表达(×200)

2.2 急慢性AA患者治疗前后的骨髓VEGF比较治疗后急慢性AA患者骨髓VEGF的表达较治疗前明显上调，差异有统计学意义(P＜0.05)；但治疗前后急性与慢性AA患者两组之间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 急慢性AA患者治疗前后骨髓VEGF比较(pg/mL，x-±s)

2.3 急慢性AA患者骨髓VEGF表达与健康人比较急慢性再生障碍性贫血患者骨髓血管内皮生长因子-C治疗前[(139.45±24.39)pg/mL、(134.78±25.24)pg/mL]和治疗后[(73.12±20.18)pg/mL、(66.23±21.86)pg/mL]均显著低于对照组[(170.51±29.64)pg/mL]，差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

AA为获得性骨髓造血功能异常，表现为骨髓造血细胞增生，外周血全血细胞减少，主要由贫血、出血、感染引起，AA病情进展迅速，死亡率高且易复发，严重威胁生命健康。AA发病机制复杂，可能与物理、化学、生物等因素有关，人体骨髓造血干细胞损伤、造血微环境及免疫调节改变等也可导致AA，造成血管密度减低，骨髓造血功能衰竭等系列病理改变，发生进行性贫血、出血等AA综合征。骨髓造血微环境改变可能是AA主要机制，包括神经体液、骨髓微血管等[9-10]。VEGF与AA有一定的相关性，AA患者血清中血管内皮细胞生长因子的表达与健康志愿者存在一定的差异[11]。因此本研究采用原位杂交法探讨骨髓VEGF-C在AA中的表达及意义。

研究结果发现，再生障碍性贫血VEGF-C主要表达于骨髓基质细胞，急慢性AA患者VEGF阳性13例，阳性表达率为20.63%。AA患者骨髓VEGF-C的表达明显低于健康志愿者，治疗后AA患者骨髓VEGF-C的表达较治疗前上调。说明骨髓VEGF-C的表达与AA患者的发病急慢程度无关，而与疾病发病机制和治疗有关。由于VEGF具有提高血管通透性、诱导内皮细胞增殖、促进血管形成的作用，骨髓VEGF-C的表达下调，说明AA患者的发病机制可能与血管通透性和内皮细胞有关[12-13]。通过治疗后，AA患者骨髓VEGF-C表达上调，可能是由于VEGF旁分泌对血管内皮细胞受体F1t-1和KDR的调节作用，促使微血管通透性增加，形成纤维凝胶支持新生血管的生长，促进新生血管生成[14-15]。AA患者骨髓VEGF低表达，导致骨髓血管生成减少，影响骨髓局部血液供应，减少骨髓造血细胞的营养供给，进而影响骨髓正常造血，导致AA。

综上所述，AA患者骨髓VEGF-C的表达低于健康志愿者，阳性率较低，常规治疗后VEGF-C的表达上升。因此，采用原位杂交法检测骨髓VEGF-C对AA的诊断、发病机制及治疗具有重要意义。

[1]Scheinberg P.Aplastic anemia:therapeutic updates in immunosuppression and transplantation[J].Hematology Am Soc Hematol Educ Program,2012,2012:292-300.

[2]林灿华.再生障碍性贫血骨髓与静脉血液中脂质含量研究分析[J].中国医药指南,2012,10(9):27-28.

[3]吴迪炯,周郁鸿,叶宝东,等.血液病与骨髓微血管研究进展[J].中国实用内科杂志,2011,31(11):871-873.

[4]杨方方,王康玮,向琪,等.复方皂矾丸对慢性再生障碍性贫血骨髓MVD、VEGF的影响[J].中国实验血液学杂志,2015,23(2):477-480.

[5]王安全,马传香,李密密,等.再生障碍性贫血患者治疗前后血管内皮生长因子的表达及意义[J].山东医药,2010,50(27):98-99.

[6]王能勇.VEGF在再生障碍性贫血中的表达及其意义[J].中外医疗,2010,15:63-64.

[7]刘双,滕清良.VEGF,bFGF在再生障碍性贫血患者骨髓中的表达及意义[J].山东医药,2009,49(11):44-45.

[8]张之南,沈梯.血液病诊断及疗效标准[M].第3版.北京:科学出版社,2007:20-21.

[9]杨利,王风仁.再生障碍性贫血骨髓小粒细胞成分分析[J].中国卫生检验杂志,2014,24(23):3428-3429.

[10]Young NS,Bacigalupo A,Marsh JC.Aplastic anemia:pathophysiology and treatment[J].Biol blood marrow transplant,2010,16(Suppl 1):5119-5125.

[11]刘瑞玉,巫远忠,范火亮,等.再生障碍性贫血患者血清sVCAM-1、IL-18和VEGF水平及其临床意义[J].中国实验血液学杂志,2009,17(1):117-120.

[12]甄萍,姚新洁,乔艳梅.血管内皮细胞生长因子与同型半胧氨酸检测在贫血诊断中的意义[J].临床血液学杂志,2011,24(8):458-459.

[13]于桂芬,王莹,闰冬梅.再生障碍性贫血患者治疗前后血清IL-8、TNF-α、VEGF检测的临床评估[J].放射免疫学杂志,2011,24(6):633-634.

[14]王海霞,王安全,田丛丛,等.愈障颗粒对非重型再生障碍性贫血患者骨髓小粒中VEGF农达的影响[J].陕西中医学院学报,2013,36(3):92-94.

[15]王文文,王树庆.补肾活髓颗粒对肾虚血,型非重型再生障碍性贫血患者骨髓VEGF影响的临床研究[J].江苏中医药,2011,43(11):19-20.

Expression of vascular endothelial growth factor-C in patients with aplastic anemia.

JIANG Rui,ZHOU Ni,WANGQiong,FANG Jie,YANG Pei-xian.Department of Hematology,the 105thHospital of Chinese PLA,Hefei 230031,Anhui,CHINA

ObjectiveTo study the expression vascular endothelial growth factor-C(VEGF-C)in marrow of patients with acute and chronic aplastic anemia.MethodsThe expression levels of VEGF-C in marrow of patients with acute(38 cases)and chronic(25 cases)aplastic anemia who were treated in the 105thHospital of Chinese PLA from May 2012 to May 2015 was detected by in situ hybridization,and then compared with those of healthy volunteers(20 cases)ResultsThe expression of VEGF-C in marrow of aplastic anemia was located in the stromal cell,and the positive expression rate was 20.63%.After treatment,the expression of VEGF-C in marrow of patients with acute and chronic aplastic anemia were(139.45±24.39)pg/mL,(134.78±25.24)pg/mL,which were significantly higher than(73.12±20.18)pg/mL,(66.23±21.86)pg/mL before treatment and lower than(170.51±29.64)pg/mL of healthy volunteers after treatment(P＜0.05).The expression of VEGF-C showed no statistically significant difference between patients with acute aplastic anemia and those with chronic aplastic anemia(P＞0.05).ConclusionThe expression of VEGF-C in marrow of patients with aplastic anemia is lower than healthy volunteers,and the expression increases after treatment,which indicates that VEGF-C provides a detection index for the diagnosis and treatment of patients with aplastic anemia.

Aplastic anemia;Acute;Chronic;Vascular endothelial growth factor-C(VEGF-C);Marrow

R556.5

A

1003—6350（2017）18—2945—03

2017-03-02)

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.18.006

江瑞。E-mail：hbdyl81@163.com