去水淫羊藿素对大鼠视网膜缺血/再灌注损伤的保护作用

吕昊琴，吴维霖，刘艳芳，刘锦荣，刘星芳，谢佳丽，黄志华，王辉

(1.赣南医学院研究生学院，江西赣州341000；2.赣南医学院生理学教研室，江西赣州341000；3.赣南医学院第一附属医院眼科，江西赣州341000)

去水淫羊藿素对大鼠视网膜缺血/再灌注损伤的保护作用

吕昊琴1，吴维霖1，刘艳芳3，刘锦荣1，刘星芳1，谢佳丽1，黄志华2，王辉3

(1.赣南医学院研究生学院，江西赣州341000；2.赣南医学院生理学教研室，江西赣州341000；3.赣南医学院第一附属医院眼科，江西赣州341000)

目的研究去水淫羊藿素(ICT)对大鼠视网膜缺血/再灌注损伤是否具有保护作用，并初步探讨其作用机制。方法将40只SD大鼠采取随机数表法分为5组(n=8)，通过夹闭一侧颈总动脉的方法构建大鼠视网膜缺血/再灌注(I/R)模型。分别于夹闭前，一次性经腹腔注射不同剂量(1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg)ICT；假手术组及模型组给予等体积生理盐水腹腔注射；假手术组只分离不夹闭，模型组与药物组建立视网膜I/R模型。各组分别在夹闭前、缺血30 min时行视网膜电流图(ERG)、眼底照相检查以及再灌注1 h后行ERG、眼底荧光血管造影(FFA)检查。再灌注6 h后获取视网膜，通过免疫印迹法检测白介素10(IL-10)蛋白表达水平。结果与模型组比较，ICT治疗组能显著改善ERG的a波、b波振幅降低，使后极部视网膜缺血动脉明显扩张，并且能升高视网膜I/R损伤后视网膜组织IL-10蛋白表达水平[(1.02±0.44)vs(0.47±0.21)]，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论ICT对视网膜缺血/再灌注损伤具有保护作用，其保护机制可能与上调抗炎细胞因子IL-10蛋白表达水平，抑制炎症反应有关。

去水淫羊藿素；视网膜；缺血再灌注损伤；IL-10；电流图

视网膜缺血性眼病是临床上常见的一种致盲性眼病，缺血-再灌注视网膜损伤(retinal ischemia reperfusion injury，RIRI)是其治疗过程中常发生的病理过程，主要表现为缺血视网膜恢复血液供应后，患者视力未见改善反而视网膜出现明显功能障碍。目前，关于视网膜缺血/再灌注损伤的确切发病机制尚未完全清楚。有研究发现，再灌注最早表现为缺血区白细胞堆积和炎性细胞因子增多，可见炎症反应在缺血/再灌注视网膜损伤的发病机理中发挥着重要作用。去水淫羊藿素(icaritin，ICT)是巫山淫羊藿、箭叶淫羊藿、朝鲜淫羊藿等干燥茎和叶的水提取物。国内外有学者研究发现，ICT具有抗肿瘤[1]、抑制骨质疏松[2]、抗纤维化[3]等药理活性。此外，本课题组前期研究结果表明，ICT具有中枢抑制[4]、耐缺氧[5]、镇痛[6]以及保护脑缺血再灌注损伤作用[7]。本实验通过建立视网膜I/R损伤模型，研究去水淫羊藿素对视网膜缺血再灌注损伤是否有保护作用，并探讨其保护作用与IL-10的关系。

1 材料与方法

1.1 试剂与药物去水淫羊藿黄素(C21H20O6)为黄色结晶粉末，分子量为368.38，由(上海)天习化工有限公司提供，纯度99%以上，实验前采用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)及超纯水溶解至所需浓度。DMSO购自Sigma公司(货号：D2650)，IL-10抗体购自Santa Cruz公司(货号：SC-365858)，超强信号west pico stable peroxide solution(Thermo公司，货号：1862419)，超强信号west pico luminal/enhancer solution(Thermo公司，货号：1862418)，Western bloting luminal reagent(Santa cruze，货号：Sc-2048)，BCA蛋白定量试剂盒(北京，天根生化科技有限公司，货号：P4715/P4321)，美多丽滴眼液(日本，参天制药株式会社)，荧光素钠注射液(中国，爱尔康眼科产品有限公司)，水合氯醛(国药集团上海化学试剂有限公司)，乙醇、液氮、生理盐水、SDS-PAGE电泳液、1×转膜液(赣南医学院科研中心)。

1.2 实验动物40只SPF级SD雄性大鼠，体质量为(300±25)g，购自赣南医学院动物实验中心，动物中心许可证号：SCXK(赣)2014-0001。饲养条件：SPF级动物房，12 h光照/12 h黑暗的自然昼夜光线照明，室内通风良好，室温恒定在(25±2)℃，标准颗粒饲料，自由饮水和摄食，适应性饲养5～7 d后开始实验。

1.3 所用仪器RetiMNER-S视觉电生理仪(重庆艾尔曦医疗设备有限公司)，CF-60UD眼底照相及眼底血管荧光造影仪(日本，科林，佳能)，Universal HoodⅡ型超灵敏度化学发光成像系统(美国，Bio-Rad公司)，多功能酶标仪-3001型(美国，Thermo公司)。

1.4 实验方法[8-10]

1.4.1 分组与构建视网膜I/R模型SPF级SD雄性大鼠40只，采用随机数表法将其分为5组(n=8)，即假手术组、视网膜I/R模型组(简称模型组)、I/R+低剂量(1.0 mg/kg)ICT治疗组、I/R+中剂量(2.0 mg/kg)ICT治疗组及I/R+高剂量(4.0 mg/kg)ICT治疗组。采用体积分数为10%的水合氯醛(按350 mg/kg)经腹腔注射将老鼠麻醉，固定于动物解剖板上，用75%乙醇消毒颈部皮肤，于颈部正中线切开大鼠皮肤，用止血钳将皮下组织逐层进行钝性分离，暴露出右侧颈总动脉，动脉夹夹闭右侧颈总动脉，60 min后松开动脉夹，缝合皮下组织及皮肤，构建大鼠视网膜I/R模型。假手术组仅分离出颈总动脉，不进行夹闭。术中严格控制室温在23℃～25℃。药物组和对照组在夹闭颈总动脉前分别经腹腔注射1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg的ICT和等体积的生理盐水。

1.4.2 ICT对视网膜缺血/再灌注损伤的影响麻醉大鼠后，用美多丽滴眼液散瞳，将大鼠固定在动物解剖板上，分别在夹闭大鼠颈总动脉前和缺血30 min时行视网膜电流图(ERG)和眼底照相及眼底荧光血管造影(FFA)检查；再灌注1 h后分别行ERG和FFA检查。

1.4.3 视网膜IL-10蛋白表达水平检测再灌注6 h后，用大剂量麻药麻醉大鼠(方法同1.4.1)致死，迅速摘下眼球，置于冰浴中，依次去除角膜、虹膜、晶状体及玻璃体，获取视网膜后迅速放入液氮罐中，后置于-80℃冰箱保存。提取组织蛋白后采用BCA蛋白定量试剂盒，按试剂盒说明书严格进行操作，蛋白定量完毕后，采用Western blot法检测视网膜组织IL-10的表达水平。根据所测蛋白分子量大小制备12%的SDS-PAGE分离胶和5%的浓缩胶进行蛋白电泳后，严格按照湿法转膜的步骤进行转膜，转膜完毕后将硝酸纤维素膜(nitrocellulosee，NC)(Pall Gelman Laboratory，USA)封闭于5%脱脂牛奶中，室温下水平摇床摇1 h。加入合适比例稀释的IL-10抗体后封入杂交袋中，4℃水平摇床过两夜一天。取出NC膜后，用1×TBST洗涤5 min×3次，加入与一抗对应的二抗，按1:1 000比例，封入杂交袋，挤除所有气泡，室温水平摇床摇1 h。用1×TBST洗二抗10 min×3次后，将化学发光液A、B等量混合，采用超高灵敏度化学发光成像系统照相并用图像分析软件测定灰度值。

2 结果

2.1 ICT对ERG的影响假手术组可见明显的a波和b波；模型组在缺血时ERG波形完全消失，再灌注1 h时a波、b波稍有恢复；模型组和ICT治疗组在视网膜缺血30 min时ERG的a波和b波的振幅明显降低；再灌注后1 h，与模型组比较，ICT治疗组能显著改善ERG的a波、b波振幅降低，见图1。提示在整体水平，ICT对视网膜缺血再灌注损伤具有保护作用。

2.2 ICT对FFA的影响与假手术组比较，模型组大鼠夹闭一侧颈总动脉后视网膜血管出现痉挛、变细，视网膜后极部出现明显的缺血变白，视乳头周围出现轻度水肿；缺血时及再灌注后，与模型组比较，给予ICT治疗后后极部视网膜痉挛血管得到明显恢复，见图2。进一步提示在整体水平，ICT对视网膜I/R损伤具有保护作用。

图1 ICT对大鼠视网膜缺血30 min及再灌注1 h后ERG的影响

图2 ICT对大鼠视网膜缺血前、缺血30 min时及再灌注1 h后眼底照相的影响

2.3 ICT对大鼠视网膜I/R损伤时视网膜组织IL-10蛋白表达的影响图3为Western blot的结果，结合表1所示，与假手术组比较，模型组大鼠视网膜组织IL-10蛋白表达降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；1.0 mg/kg、2.0 mg/kg及4.0 mg/kg ICT治疗后，视网膜I/R损伤视网膜组织中IL-10蛋白表达水平均有升高，尤其是2.0 mg/kg ICT组，与模型组比较差异有统计学意义(q=4.592，P＜0.05)。

图3 ICT对大鼠视网膜缺血再灌注损伤时视网膜组织IL-10蛋白表达的影响

3 讨论

视网膜缺血再灌注损伤常发生在DR、ROP、视网膜血管阻塞性疾病、急性闭角性青光眼等治疗过程中。缺血视网膜实现血流再通后，由于缺血导致的视网膜功能障碍并没有得到缓解反而更加严重，呈现出细胞不可逆性损伤，可见，再灌注并不能使视网膜损伤得到缓解，却使细胞死亡加剧，这就是视网膜缺血/再灌注损伤。大量研究表明，炎症反应、细胞凋亡、兴奋性氨基酸、氧自由基、NO、钙超载等多因素、多环节参与视网膜缺血再灌注损伤[11-12]。

ERG是一种记录视网膜的视感细胞在光刺激作用下产生的一组复合电位变化情况的方法，对掌握视网膜的状况具有特异性。其中，a波主要由光感受器产生，b波振幅的波动对反映视网膜缺血再灌注损伤程度具有重要作用[13]。因此，检测大鼠视网膜的ERG可以反映组织及细胞的损伤程度。本实验结果发现，模型组眼底照相和FFA显示夹闭大鼠一侧颈总动脉后视网膜血管出现痉挛、变细，视网膜后极部出现明显的缺血变白，视乳头周围出现轻度水肿，同时ERG显示其a波和b波的振幅明显降低；1.0 mg/kg、2.0 mg/kg及4.0 mg/kg ICT治疗后，视网膜I/R损伤视网膜后极部痉挛血管得到明显恢复，ERG的a波、b波振幅降低程度得到显著改善。这表明本实验制备的视网膜I/R损伤模型是成功的，且ICT对大鼠短暂性视网膜缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。

有实验发现，视网膜I/R损伤后可使内源性IL-1和IL-6表达增加，改变血流动力学，诱导白细胞向缺血组织浸润，活化血管内皮细胞产生自由基、NO，刺激中性粒细胞释放炎性反应蛋白和炎性介质，从而加剧炎性反应导致迟发神经元损伤[14]。IL-10作为一种炎性抑制因子，可通过抑制IL-1、IL-6等的受体的表达等来减轻炎症反应，从而减轻组织损伤[15]。本实验结果显示，给予ICT治疗后，视网膜IL-10蛋白表达水平升高，尤其是2.0 mg/kg ICT，与模型组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

综上所述，ICT对视网膜I/R损伤具有一定的保护作用，且上调IL-10蛋白表达水平，抑制炎症反应是其可能的机制之一。但ICT的化学结构与雌激素类似，是一种植物性雌激素，其对视网膜缺血/灌注损伤的保护作用机制还有待于进一步探究。

[1]Sun L,Peng Q,Qu L,et al.Anticancer agent icaritin induces apoptisis through caspase-dependent pathways in human hepatocellular carcinoma cells[J].Mol Med Rep,2015,11(4):3094-3100.

[2]Jiang J,Li J,Jia X.The antiosteoporotic activity of central icaritin(CIT)on bone metabolism of ovariectomized rats[J].Molecules,2014,19(11):18690-18704.

[3]Liu P,Jin X,Lv H,et al.Icaritin ameliorates carbon tetrachloride-induced acute liver injury mainly because of the antioxidative function through estrogen-like effects[J].In Vtro Cell Dev Biol Anim,2014,50(10):899-908.

[4]赖飞,曾靖,黄贤华,等.淫羊藿水提取液中枢抑制作用的研究[J].赣南医学院学报,2003,23(3):268-270.

[5]曾靖,黄贤华,叶和杨,等.淫羊藿水提取液的耐缺氧作用[J].赣南医学院学报,2002,22(4):326-328.

[6]李良东,黄志华,曾靖,等.淫羊藿水提取液镇痛作用的研究[J].赣南医学院学报,2004,24(1):14-16.

[7]赖丽娟,刘星芳,陈琴,等.去水淫羊藿素对脑缺血再灌注损伤氧化应激的影响[J].赣南医学院学报,2015,35(1):14-17.

[8]Minhas G,Morishita R,Shimamura M,et al.Modeling transient retinal ischemia in mouse by ligation of pterygopalatine artery[J].Ann Neurosci,2015,22(4):222-225.

[9]Minhas G,Morishita R,Anand A.Preclinical models to investigate retinal ischemia:advances and drawbacks[J].Front Neurol,2012,3:75.

[10]曾靖,黄志华,李良东,等.3'-大豆苷元磺酸钠对大鼠脑缺血再灌注损伤后视网膜作用的影响[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(12):197-199.

[11]杨丹,余德江,余资江.视网膜缺血再灌注损伤的机制及药物治疗进展[J].局部手术学杂志,2012,21(5):561-563.

[12]朱远军,金敏.视网膜缺血再灌注损伤机制研究进展[J].中国病理生理杂志,2007,23(1):195-200.

[13]Lavoie J,Maziade M,Hébert M.The brain through the retina:the flash electroretinogram as a tool to investigate psychiatric disorders[J].Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,2014,48:129-134.

[14]Li SY,Fung FK,Fu ZJ,et al.Anti-inflammatory effects of Lutein in retinal ischemic/hy-poxic injury:in vivoandin vitrostudies[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2012,53(10):5976-5984.

[15]Grilli M,Barbieri I,Basudev H,et al.Interleukin-10 modulates neuronal threshold of vulnerability to ischaemic damage[J].Eur J Neurosci,2000,12(7):2265-2272.

Protective effects of icaritin on retinal ischemia/reperfusion injury in rats.

LV Hao-qin1,WU Wei-lin1,LIUYan-fang3,LIU Jin-rong1,LIU Xing-fang1,XIE Jia-li1,HUANG Zhi-hua2,WANG Hui3.1.Graduate Faculty of Gannan Medical University,Ganzhou 341000,Jiangxi,CHINA;2.Department of Physiology,Gannan Medical University,Ganzhou 341000,Jiangxi,CHINA;3.Department of Ophthalmology,the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University,Ganzhou 341000,Jiangxi,CHINA

ObjectiveTo explore the protective effects of icaritin(ICT)on retinal ischemia/reperfusion injury in rats and its potential mechanism.MethodsForty Sprague-Dawley rats were assigned into the five groups according to random number tables,with 8 cases in each group.The model of retinal ischemia/reperfusion injury was induced by the ligation of the common carotid artery unilaterally.Respectively,these rats were randomized to receive intraperitoneal injection of saline,at the dosage of 1.0 mg/kg,2.0 mg/kg,4.0 mg/kg of ICT before the induction of retinal I/R injury.The rats in the sham group were isolated without ligation of the common carotid artery,and the retinal I/R model was established in the model group and the drug group.Electroretinography(ERG)and fundus photography were used to assess functional changes in retina before and 30 minutes after ligation.One hour after reperfusion,ERG and fluorescein fundus angiography(FFA)were performed.After 6 h of reperfusion,the rats were sacrificed and the eyeballs were extracted for retina.The expression of interleukin 10(IL-10),one of anti-inflammatory mediators was quantified by Western blot analysis.ResultsCompared with the model group,the ICT groups ameliorated notably the decrease of the amplitudes of the a-and b-waves and significantly dilate retinal vessels.Besides,the level of IL-10 in the retinal tissue after retinal I/R damage increased,especially in 2.0 mg/kg ICT group(P＜0.05).ConclusionICT has a protective effect in retinal ischemia/reperfusion injury,possibly by increasing the expression of IL-10 and suppressing inflammation.

Icaritin(ICT);Retinal;Ischemia/reperfusion injury;Interleukin 10(IL-10);Electroretinography

R-332

A

1003—6350（2017）18—2932—04

2017-07-24)

10.3969/i.issn.1003-6350.2017.18.003

王辉。E-mail：gyfywanghui@163.com