结肠癌microRNA表达谱检测及生物信息学分析

黄幼生，翁阳，解娜，张艺馨，罗志飞，薛逢贵

(海南医学院第一附属医院病理科，海南海口570102)

结肠癌microRNA表达谱检测及生物信息学分析

黄幼生，翁阳，解娜，张艺馨，罗志飞，薛逢贵

(海南医学院第一附属医院病理科，海南海口570102)

目的探讨miRNA(microRNA，微小RNA)在结肠癌组织中的表达特征及生物学功能。方法选取临床特征相似的3对结肠癌组织及其配对正常黏膜组织，应用Exiqon miRNA芯片检测miRNA在结肠癌及其配对组织中差异表达情况；3个差异表达的miRNA被选取进行qPCR验证；生物信息学分析差异表达的miRNA及其靶向基因在结肠癌进展中的作用机制。结果芯片结果显示，在3对结肠癌组织中有201个miRNA出现上调表达，94个下调表达(差异倍数＞2)，差异有统计学意义(P＜0.05)。qPCR结果显示，与对照组织比较，选取的3个miRNA中hsa-miR-18b-3p、hsa-miR-31-5p在结肠癌组织中表达上调，hsa-miR-142-3p表达下调，与芯片结果一致，差异有统计学意义(P＜0.05)。GO及pathway分析显示差异表达的miRNA涉及结肠癌细胞的分化、迁移、定位、增生及RNA、蛋白合成等功能调控，与细胞粘附、结肠癌发生发展等信号途径的激活相关。结论结肠癌组织中miRNA存在异常表达，可能涉及结肠癌的发生、发展。

miRNA；结肠癌；差异表达；生物信息学；miRNA芯片

结肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率居第五位[1]。转移、复发的晚期结肠癌患者主要依靠药物治疗，虽然靶向治疗取得了一定的成效，但因靶向药物少，易耐药等缺点，使得转移性结肠癌患者的预后仍然不理想，因而阐明结肠癌发病的分子机制、寻找分子靶标、开发靶向药物是改善治疗措施、提高患者预后的关键[1-2]。miRNA(microRNA，微小RNA)是一类非编码RNA，大小21～25个核苷酸，由约70 nt大小的可形成发夹结构的前体加工而来，其作用是在转录水平上对基因表达产生抑制性作用[3]。越来越多的资料显示，miRNA结构或表达的异常与肿瘤的发生密切相关，涉及肿瘤的浸润、转移、分期及预后等[3-5]。许多研究证实miRNA异常表达参与了结肠癌的发生发展，是结肠癌诊断、治疗或判断预后的候选生物标志[6-7]。

本课题利用Exiqon miRNA寡核苷酸芯片，检测3对结肠癌及其配对组织的miRNA表达特征。应用生物信息学分析差异表达的miRNA生物学功能及其在结肠癌发生发展中所起的作用，为阐明结肠癌的发病机制、寻找分子靶标、开发靶向药物奠定分子理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料3对结肠癌及其配对正常的结肠黏膜组织(距离肿瘤边缘5 cm)均来自海南医学院第一附属医院2014年1月手术切除标本，其使用已获得患者知情同意。患者信息从临床病例信息中心提取，所有病例术前均未接受放化疗，病理诊断、分型、分期由两位高级职称病理专家HE切片确诊。

1.2 主要试剂miRCURYTM Array Power标记试剂盒(Cat#208032-A)、miRCURYTM LNA芯片(v.18.0)购自Exiqon公司产品。TRIzol®Reagent为Invitrogen life technologies产品；RNasey Mini试剂盒购自QIAGEN公司；miRcute miRNA第一链cDNA合成试剂盒、miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒购于北京天根生物技术有限公司。

1.3 组织总RNA提取及纯化3对结肠癌及其配对组织使用BioPulverizer™进行组织破碎匀浆，使用TRIzol试剂盒提取组织总RNA，具体提取及纯化步骤按TRIzol及RNasey Mini试剂盒使用说明书进行。RNA浓度及纯度使用NanoDrop ND-1000测量，1.5%凝胶电泳检测RNA完整性。

1.4 RNA标记与芯片杂交RNA标记及芯片杂交具体操作由上海康成生物有限公司完成，简而言之，采用Fluorescent label(Hy3TM)标记纯化的RNA。标记完成后，根据Exiqon的实验方法将样品与miRCURYTM LNAArray(v.18.0)芯片杂交：(1)25 μL的样品与25 μL的杂交缓冲液混合，95℃变性2 min，随即置于冰上2 min。(2)应用杂交系统(Nimblegen Systems，Inc，Madison，WI，USA)，将样品与芯片56℃下杂交18 h。(3)杂交完成后，使用Wash buffer kit(Exiqon)清洗芯片，应用Axon GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片。

1.5 数据分析GenePix Pro6.0软件读取芯片图像、提取探针信号值，相同的探针取中值合并。保留在所有样品中均≥30.0的探针，进行中值标准化，筛选差异表达探针。使用倍数变化(＞2.0)及P值(P＜0.05)筛选两组样品间差异表达的miRNA。最后，对差异表达miRNAs进行聚类并绘制聚类图。miRNA Raw数据提交至美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus database，GEO)，通过号为GSE101502。

1.6 实时定量PCR(qPCR)验证应用Primer 6.0软件设计3个被选取进行qPCR验证的miRNA引物，由英骏生物公司合成，引物序列见表1。应用ABI ViiA7 Real-time PCR仪进行逆转录及PCR反应，简述如下：采用miRcute miRNA第一链cDNA合成试剂盒进行逆转录，miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒进行PCR反应，具体操作按试剂盒说明书进行。反应体系：2×SYBR Green mix 10 μL，通用引物(10µmol/L)0.4 μL，特异引物(10µmol/L)0.4 μL，cDNA 1 μL，50×ROX Reference Dye 1 μL，RNase-free水补充至体积20 μL。反应条件：94℃预反应2 min，94℃20 s、60℃34 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算miRNA相对表达值，U6 snRNA为内参。

1.7 生物信息学分析检索miR2Disease与miRCancer数据库中癌症相关miRNA，BioVenn软件在线筛选本文中差异表达的miRNA与两大数据库下载的肿瘤相关miRNA三方重叠数据。应用mircocosm、targetscan及miranda在线软件预测差异表达miRNA可能的靶向基因，利用在线miRTarBase软件(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/)下载差异表达miRNA实验已验证的靶向基因，剔除两者重复项，应用在线数据库DAVID系统(http://david.ncifcrf.gov/)将获得的靶向基因进行GO(Gene ontology)及KEGG pathways富集分析。

表1 miRNA特异性引物及U6引物列表

1.8 统计学方法miRNA芯片及qPCR数据均为计量资料，以均数±标准差(x-±s)表示。miRNA芯片检测数据采用芯片显著性分析(significance analysis of microarray，SAM)；qPCR检测数据应用SPSS18.0统计学软件进行Student'st检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标本信息及RNA提取3对结肠癌病例为近期手术切除标本，患者病理及临床资料相对接近。3例均为男性，62～64岁(平均年龄62.7岁)，TNM分期Ⅱ的高分化结肠管状腺癌患者。总RNA提取完成后，NanoDrop检测显示各标本总RAN OD260/280在1.97～2.01之间，总含量均超过30 μg；1.5%凝胶电泳鉴定显示，各标本均有3条清晰的泳带，28S、18S清晰明亮。表明提取的总RNA含量充足，可用于芯片检测及qPCR分析。

2.2 miRNA芯片表达分析芯片结果显示超过2 000个miRNA在结肠癌组织中存在表达，295个miRNA在癌组织及其配对组织间出现不同程度的差异表达(具体请查询GEO：GSE101502)。其中，相对配对组织，有201个miRNA在结肠癌组织内出现上调表达，94个出现下调表达(差异倍数＞2)，差异有统计学意义(P＜0.05)。前10上调及下调表达的miRNA见表2。为更直观地了解结肠癌及其配对正常黏膜组织中miRNA的表达特征，无监督层次聚类与相关分析被执行。结果显示6组miRNA很清晰的分为两大组，对应结肠癌组织及其配对组(图1)，表明与正常黏膜组织比较，miRNA在结肠癌组织中的表达出现异常变化。

表2 差异表达前10的miRNA(结肠癌/配对正常结肠黏膜组织)

2.3 qPCR验证为了验证miRNA芯片数据的可靠性，3个差异表达的miRNA(hsa-miR-18b-3p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-31-5p)被选取执行qPCR检测。结果显示，在这3对结肠癌组织中，相比对照组织，hsa-miR-18b-3p、hsa-miR-31-5p出现上调表达，hsa-miR-142-3p下调表达(表3)，差异有统计学意义(P＜0.05)，与芯片检测的结果基本一致，表明miRNA芯片检测结果真实有效(图2)。

2.4 生物信息学分析从miR2Disease、miRCancer数据库下载癌症相关miRNA，剔除重复项，共获得700余个miRNA，其中结肠癌相关miRNA 252个。将本研究中差异表达的miRNA与这两群数据相比较，通过BioVenn在线软件分析发现有14个miRNA与两大数据库结肠癌相关miRNA重叠，包括：hsa-miR-31-5p及hsa-miR-142-3p。本研究以qPCR验证有差异表达的hsa-miR-31-5p、hsa-miR-142-3p为模板，应用mircocosm、targetscan及miranda数据库在线预测其可能的靶向基因，Bio-Venn分析三大数据库重叠的基因(87条)作为预测可靠的靶向基因，再从mitarBASE数据库[8]下载已有实验验证的靶向基因(86条，至少有两种方法证实)，剔除重复项，共计获得149个靶向基因。应用DAVID数据库对这149个靶基因进行在线GO及KEGG pathways富集分析，分析发现，这些miRNA的靶向基因与细胞分化、细胞迁移、细胞定位、细胞增生、RNA及蛋白合成等功能调控有关，涉及细胞粘附、结肠癌发生发展等相关信号途径的激活(图3)。

图1 结肠癌组织差异表达miRNA聚类分析图

表3 3个miRNAs在结肠癌及其配对组织中的qPCR检测结果(x-±s)

图2 qPCR/miRNA芯片检测miRNA表达结果比较图

图3 KEGG分析P值前10信号途径

3 讨论

miRNAs是具有调控mRNA表达功能的非编码RNA，调控大概三分之一人类基因mRNA的表达。miRNA通过与靶基因互补结合，切割mRNA，抑制靶基因的翻译，调控基因表达[3-4]。越来越多的研究表明，miRNA的异常表达可引起肿瘤相关基因的激活或失活，参与调控细胞分化、凋亡、增生及肿瘤的浸润、转移等，促进肿瘤的发生、发展[3-7]。

目前，生物芯片的应用越来越广泛，是筛选疾病相关miRNA最常用的方法之一。应用该项技术发现每种肿瘤都有其特异的miRNA表达谱，更能准确地进行组织分类及肿瘤分型[3-5,9]。Volinia等[10]应用540例各种癌症组织标本进行miRNA表达谱差异分析，发现miRNA在的表达具有组织特异性，组合性检测上调表达的21个miRNA能正确区分、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌和肺癌等组织。本研究应用Exiqon miRNA芯片检测3对结肠癌组织及其配对正常组织，发现相比配对正常组织，有201个miRNA在结肠癌组织中上调表达，94个下调表达，qPCR的验证结果与芯片一致，表明miRNA在结肠癌组织中存在表达异常。

近年来，研究miRNA在结直肠癌组织中表达情况的报道逐渐增多[6,7,11-13]。通过文献复习分析发现有接近600个miRNA被发现在结直肠癌组织中存在差异表达，主要上调表达的有miR-181b，miR-106b，miR-92a，miR-31，miR-29a，miR-29b，miR-21，miR-20a，miR-19a，miR-18a，miR-17等，下调表达的主要有miR-192，miR-142，miR-133a，miR-129，miR-101，miR-34a，miR-30a，miR-30c，miR-9，let-7a，miR-1等，涉及肿瘤细胞的分化、增生、浸润、转移、药物抗性等多种生物学功能，认为能够作为结肠癌诊断、预后、复发及药物疗效的标记物。然而异常表达的miRNA在不同的研究中重合率较低，重复性差。本文通过检索miRCancer与miR2Disease数据库，共获得252个结肠癌相关miRNA，来源于500余篇文献，分散度大。本文发现的295个差异表达的miRNA仅仅14个曾报道与结肠癌相关。造成重复性差的原因可能与结肠癌组织的异质性、个体和种族的差异性及采用的研究方法等的不同有关。

miRNA通过靶向序列的互补性调控靶基因的表达，发挥其生物学功能，根据miRNA序列预测其靶基因是研究miRNA功能的常用方法之一[3-5,9]。目前，预测miRNA靶向基因的在线软件比较有名的有Targetscan，miRbase、mircocosm及miranda等[14]。本研究采取Targetscan，mircocosm及miranda预测(miRNA hsa-miR-31、hsa-miR-142)的靶向基因，三者重叠的靶基因作为可靠的预测结果。本文通过检索mitarBASE数据库[8]获取已有实验验证的miRNA(hsa-miR-31、hsa-miR-142)靶向基因，两种方法共获得149个靶向基因。GO及KEGG分析发现这些miRNA的靶向基因与细胞分化、细胞迁移、细胞定位、细胞增生、RNA及蛋白合成等功能调控有关，涉及细胞粘附、结肠癌发生发展等相关信号途径的激活。

综上所述，多量的miRNA在结肠癌组织中存在表达异常，这些异常表达的miRNA可能参与结肠癌的发生、发展。更多的实验去探索这些差异表达的miRNA在结肠癌组织中的功能及作用方式有助于阐明结肠癌生物学进程的分子机制。

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Expression profile of microRNAs and bioinformatics analysis in human colon cancer tissues.

HUANG You-Sheng,WENG Yang,XIE Na,ZHANG Yi-xin,LUO Zhi-fei,XUE Feng-gui.Department of Pathology,the First Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570102,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression profile and biological functions of miRNAs(microRNA)in human colon cancer tissues.MethodsThe expression profiles of miRNAs were compared between 3 pairs of colon cancer and its adjacent normal tissues using a Exiqon miRNA array,following which quantitative PCR(qPCR)was employed to confirm the results of the miRNA array,and 3 differentially expressed miRNAs were selected for qPCR validation.Bioinformatics was used to analyze the biological function of the differentially expression miRNAs and its target genes in colon cancer.ResultsCompared with adjacent normal mucosal tissues,201 miRNAs were up-regulated and 94 miRNAs were down-regulated in colon cancer tissues(fold＞2),the difference was statistically significant(P＜0.05).The qPCR results showed that,compared with the control group,the expression of hsa-miR-18b-3p and hsa-miR-31-5p were up-regulated and the expression of hsa-miR-142-3p was down regulated in colon cancer tissues,which were consistent with microarray-based expression analysis,with statistically significant difference(P＜0.05).Furthermore,the online GO and KEGG pathwany analysis revealed that the differentially expressed miRNAs may be involving cell differentiation,migration,localization,proliferation,synthesis of RNA and protein and other biological functions,and perhaps related to cell adhesion and activation of signaling pathways of colon cancer development.ConclusionThere are abnormal expression of miRNAs in colon cancer tissues,which may be related to colon cancer tumorigenesis.

microRNA;Colon cancer;Differential expression;Bioinformatics;microRNAarray

R735.3+5

A

1003—6350（2017）18—2928—04

2017-07-17)

10.3969/i.issn.1003-6350.2017.18.002

国家自然科学基金(编号：81260321)

黄幼生。E-mail：hys768811@163.com