抑制真菌乳杆菌发酵培养基的优化

李晓婷，陈忠军

（内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特010018）

抑制真菌乳杆菌发酵培养基的优化

李晓婷，陈忠军

（内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特010018）

利用单因子实验和正交实验对一株具有抑真菌作用乳杆菌的发酵培养基进行优化，并测定其抑菌谱。结果表明，通过正交实验优化乳杆菌ALAC-4的最佳培养组分为蔗糖20 g/L，牛肉膏12 g/L，蛋白胨12 g/L，酵母膏6 g/L，硫酸镁0.6 g/L，硫酸锰0.3 g/L，氯化钾0.3 g/L，吐温-80 1 mL/L，其他培养基成分添加量不变。在此条件下，抑菌圈直径可达到23.05 mm，比优化前提高了31%。乳杆菌产生的抑菌活性物质抑菌谱较广，对大多数酵母菌和霉菌都有抑菌作用。

乳杆菌；抑菌活性物质；培养基优化；抑菌谱

0 引 言

真菌是发酵乳制品中常见的腐败菌，可以造成乳品工业的巨大经济损失[1,2]。乳杆菌是乳制品中常见的微生物，它能够产出有机酸、过氧化氢、双乙酰[3]，脂肪酸[4],苯乳酸[5]，细菌素[6]等物质抑制腐败微生物的生长。已有大量报道证明乳杆菌的代谢产物可以破坏食物中的腐败微生物细胞结构，提高食品安全[7,8]。作为一种天然防腐剂，乳杆菌的代谢产物满足消费者对食品防腐剂安全性的需求。

乳杆菌生长有严格的营养需求,需要充足的营养物质[9]。最常见的乳杆菌培养基是MRS[10,11]。为了提高乳杆菌的产量以获得更大的生物量及其所产有价值的代谢产物，很多报道都研究了不同碳源、氮源等营养物质对乳杆菌生长的影响，以及对温度、pH和培养时间[12-14]等培养条件进行优化。合适的培养基是提高乳杆菌抑菌作用的基础。本实验通过单因子、正交实验对一株具有良好抑真菌作用的乳杆菌ALAC-4的培养基组分进行了优化，并测定其抑菌谱，为乳杆菌应用于食品工业领域提供理论依据。

1 实验

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

乳杆菌：Lactobacillus plantarum ALAC-4（分离自内蒙古传统发酵食品）。

指示菌：白假丝酵母（Candida albicans），克鲁斯假丝酵母（Candida krusei），红酵母（Rhodotorula sp.），酿酒酵母（Sacharomyces cerevisiae），黄曲霉（Aspergillus flavus），黑曲霉（Aspergillus niger），寄生曲霉（Aspergillus parasiti⁃cus），青霉（Penicillium sp.），地霉（Geotrichum sp.），娄地青霉（Penicillium roqueforti），毛霉（Mucor niemalis）。

1.1.2 培养基

MRS基础培养基：蛋白胨10 g/L，酵母提取粉5 g/L，牛肉膏10g/L，无水乙酸钠5 g/L，柠檬酸氢二铵2 g/L，Tween-80 1 mL/L，磷酸氢二钾2 g/L，硫酸锰54 mg/L，硫酸镁200 mg/L，葡萄糖20 g/L（均为质量分数，乳杆菌培养）；马铃薯葡萄糖培养基（霉菌培养）；YEPD（酵母菌培养）；琼脂培养基（抑菌活性检测）。

1.2 仪器与设备

FLC－3型超净工作台，HVE－50型全自动高压灭菌锅，HPS-250生化培养箱，12001型电子天平，PB-10pH计，KDC-140HR高速冷冻离心机，IKARV-10旋转蒸发仪。

1.3 方法

1.3.1 指示菌菌悬液的制备[15-16]

将斜面保藏的酵母菌用接种环挑入5 mL的YEPD液体培养基中，活化3代（30℃，24 h），取第三代用生理盐水稀释至102mL-1。用于抑菌谱的测定。

将霉菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基斜面，28℃下培养7 d。加入5 mL生理盐水，用涡旋仪充分震荡，过滤菌丝，收集孢子悬液。用血球计数板调节孢子浓度至106个/mL,备用。用于抑菌谱测定和培养基优化实验。

1.3.2 抑菌活性检测[17]

将穿刺保藏的乳杆菌活化，取活化后的菌种按4%接种量接种到100 mLMRS液体培养基中，37℃培养24 h。将发酵液离心（3 500 r/min，10 min），取上清液用旋转蒸发仪浓缩至25倍。采用抑菌圈法将琼脂培养基倒入平皿中，凝固后放入牛津杯。在琼脂上层加入含有指示菌悬液的培养基。待培养基凝固后在牛津杯中加入200 μL的抑菌物质浓缩液，28℃培养48 h，测量抑菌圈直径（含牛津杯直径7 mm）。

1.3.3 单因素实验

1.3.3.1 碳源对代谢物抑菌性的影响

分别以葡萄糖、麦芽糖、D-果糖、乳糖、蔗糖、甘露糖作为初始MRS培养基中的碳源，添加量20 g/L。其余条件不变，将菌株以4%的接种量接入，37℃培养24 h，测定抑菌活性。确定最适碳源种类。

根据最适碳源的选择结果,分别加入质量浓度为10，15，20，25，30 g/L的碳源。将乳杆菌接入培养后，测定抑菌活性。确定适宜的碳源质量浓度。

1.3.3.2 氮源对代谢物抑菌性的影响

分别用酵母膏、牛肉膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、蛋白胨、麦芽提取粉、蛋白胨∶牛肉膏∶酵母膏(2∶2∶1)、牛肉膏∶酵母膏(3∶2)、牛肉膏∶蛋白胨(3∶2)、蛋白胨∶酵母膏(3∶2)，作为初始MRS培养基中的氮源，添加量25 g/L。将菌株以4%的接种量接入，37℃培养24 h，测定抑菌活性。确定最适氮源种类。

根据最适氮源的选择结果,依次加入质量浓度为5，15，25，35，45 g/L的氮源。将乳杆菌接入培养后，测定抑菌活性。确定适宜的氮源质量浓度。

1.3.3.3 金属离子对代谢物抑菌性的影响

分别在基础MRS培养基中添加质量浓度为0.8 g/L的硫酸镁∶氯化钠(2∶1)，硫酸镁∶硫酸锰(2∶1)，硫酸镁∶氯化钾(2∶1)，氯化钠∶氯化钾(2∶1)，氯化钠∶硫酸锰(2∶1)，硫酸锰∶氯化钾(2∶1)，硫酸锰∶硫酸镁∶氯化钾(1∶2∶1)，硫酸锰∶硫酸镁∶氯化钠(1∶2∶1)，硫酸镁∶氯化钾∶氯化钠(2∶1∶1)，硫酸锰∶氯化钾∶氯化钠(1∶1∶1)，硫酸锰∶氯化钾∶氯化钠∶硫酸镁(1∶1∶1∶2)。将菌株以4%的接种量接入，37℃培养24 h，测定抑菌活性。确定最适金属离子种类。

根据最适金属离子的选择结果,依次加入质量浓度为0.4，0.6，0.8，1，1.2，1.5 g/L的金属离子。将乳杆菌接入培养后，测定抑菌活性。确定适宜的添加量。

1.3.4.4 吐温-80对代谢物抑菌性的影响

在培养基中分别0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL/L的吐温-80，37℃培养24 h，测定抑菌活性。

1.3.4 正交实验确定最佳条件

依据单因素实验结果，对主要影响因素进行正交实验分析。采用L9（34）正交实验表，确定乳酸菌乳酸菌产抑霉菌物质的最佳培养基组分。并进行验证实验，对正交所得最优培养基组分进行验证。

1.3.5 抑菌谱测定

在制备的浓缩液中加入饱和硫酸铵，4℃静置24 h。冷冻离心后取沉淀（12 000 r/min,20 min），得蛋白质沉淀粗提物。用磷酸盐缓冲液溶解(pH=7.0,浓度0.1 mol/mL)，制成粗提液。以食品生产中易污染的真菌作为指示菌，测定抑菌活性，确定乳杆菌的抑菌谱。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 不同碳源对抑菌活性的影响

本研究考虑用不同糖作为碳源，添加量为20 g/L，考察其对乳杆菌所产代谢物抑菌活性的影响，结果如图1所示。以蔗糖作为ALAC-4培养基中的碳源时,所测的抑菌圈最大，乳杆菌代谢物的抑菌活性最高。因而选择蔗糖为最佳碳源。图1中，a为葡萄糖；b为麦芽糖；c为果糖；d为乳糖；e为蔗糖；f为甘露糖。不同字母之间存在差异显著性（P＜0.05）。下同。

图1 不同碳源对乳杆菌产抑菌物质的影响

在培养基中添加不同浓度的蔗糖，观察对乳杆菌所产抑菌物质抑菌活性的影响，结果如图2所示。由图2可以看出，随着蔗糖浓度的增大，抑菌物质对指示菌的抑制作用越明显，当ALAC-4培养基中蔗糖浓度在20 g/L时，对指示菌的抑菌圈直径达到最大值20.32 mm。随后两株菌的抑菌性菌明显下降。因此蔗糖的最佳质量浓度为20 g/L。

图2 蔗糖浓度对抑菌活性的影响

2.1.2 不同氮源对抑菌活性的影响

在上述实验的基础上，以10种不同氮源作为培养基中的氮源，结果如图3所示。当牛肉膏、蛋白胨、酵母膏以2∶2∶1的比例作为混合氮源添加时，乳杆菌代谢产物的抑菌性最高。而使用单一氮源的抑菌性均明显较低。因而，以牛肉膏、蛋白胨、酵母膏作为培养基的最佳氮源。图3中，a为酵母膏；b为牛肉膏；c为大豆蛋白胨；d为胰蛋白胨；e为蛋白胨；f为麦芽提取粉；g为牛肉膏：酵母膏（2∶3）；h为蛋白胨：牛肉膏（3∶2）；i为蛋白胨：酵母提取粉（3∶2）;j为蛋白胨：牛肉膏：酵母膏（2∶2∶1）。

图3 不同氮源对乳杆菌产抑菌物质的影响

在培养基中添加不同浓度的氮源，抑菌结果如图4。随着牛肉膏、蛋白胨、酵母膏总浓度的增大，抑菌物质对指示菌的抑制作用越明显，当三者总浓度在25 g/L时，抑菌圈直径达到最大值20.78 mm；随着浓度的继续增加，抑菌圈直径基本无变化。故选择氮源的最佳浓度为25 g/L。

图4 氮源浓度对抑菌活性的影响

2.1.3 无机金属离子对抑菌活性的影响

保持其他物质及浓度不变的条件下，在培养基中添加各种无机金属离子，结果显示在添加K+，Mn2+，Mg2+三种金属离子后，菌株ALAC-4所产抑菌物质的抑菌性最好（图5）。所以选取K+，Mn2+，Mg2+作为乳杆菌ALAC-4产抑菌物质培养基中的金属离子。图5中，a镁∶钠；b镁∶锰；c镁∶钾；d钠∶钾；e钠∶锰；f锰∶钾；g锰∶镁∶钾；h锰∶镁∶钠；i镁∶钾∶钠；j锰∶钾∶钠；k锰∶钾∶钠∶镁。

在乳杆菌培养基中添加不同浓度的金属离子，总添加量在0.4～1.5 g/L范围内变化。结果如图6所示，当ALAC-4培养基中金属离子添加量为1 g/L时，指示菌的抑菌圈直径达到最大值19.78 mm。因此，ALAC-4培养基中金属离子最佳添加量为1 g/L。

图5 不同金属离子对乳杆菌产抑菌物质的影响

图6 不同无机金属离子浓度对抑菌活性的影响

2.1.4 吐温-80添加量对抑菌活性的影响

在乳杆菌培养基中添加不同量的吐温-80。当培养基中吐温-80浓度达到1.0 g/L时，指示菌的抑菌圈直径达到最大值（图7）。因此，ALAC-4培养基中金属离子最佳添加量分别为1.0 g/L。

图7 吐温-80质量浓度对抑菌活性的影响

2.2 正交实验优化结果

采用正交实验L9（34）对碳源、氮源、无机属离子、吐温-80这4个因素进行研究，确定ALAC-4菌株产抑霉菌物质的最佳培养基组分。实验水平及因素如表1所示；正交实验结果及极差分析如表2所示。

表1 正交实验水平因素

表2 实验设计及数据结果

表3 抑菌谱

由表2可以看出，在菌株ALAC-4的优化发酵培养基组分中，对抑菌物质产量大小的影响程度由强到弱依次为：氮源＞金属离子＞碳源＞吐温-80，最优发酵培养基为A2B3C3D2，即葡萄糖浓度20 g/L，牛肉膏12 g/L，蛋白胨12 g/L，酵母膏6 g/L，硫酸镁0.6 g/L，硫酸锰0.3 g/L，氯化钾0.3 g/L，吐温-80 1 mL/L。

经过验证实验，在此发酵条件下抑菌圈直径为23.05 mm,与未经优化的抑菌圈直径相比增大了10%。

2.3 抑菌谱

利用牛津杯法检测株菌的抑菌谱，结果如表3所示。ALAC-4对白假丝酵母、红酵母和毛霉的抑菌效果较好；对克鲁斯假丝酵母、酿酒酵母和地霉均无抑菌性；对黄曲霉、黑曲霉、青霉有一定的抑制作用，但对寄生曲霉、娄地青霉的抑制作用不明显。

3 结论

ALAC-4菌株产抑真菌活性物质的最优发酵培养基组分为：蔗糖质量浓度20 g/L，牛肉膏12 g/L，蛋白胨12 g/L，酵母膏6 g/L，硫酸镁0.6 g/L，硫酸锰 0.3 g/L，氯化钾0.3 g/L，吐温-80 1 mL/L。经发酵条件优化后，抑菌圈直径比未经优化的抑菌圈直径提高了10%，为23.05 mm。其所产抑菌物质具有广谱抑菌性，对酵母菌和霉菌均具有一定的抑制效果。

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Optimization on fermentation medium for anti-fungal Lactobacillus

LI Xiaoting,CHEN Zhongjun

(College of Food Science and Engineering，Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018，China)

The components of fermentation medium were optimized by orthogonal experiment to improve the production of anti-fungal substance of Lactobacillus ALAC-4.And inhibitory spectrum of antifungal substance also studied.The result showed that the optimized fermen⁃tation medium were sucrose 20 g/L,beef extract 12 g/L,peptone 12 g/L,yeast extract 6 g/L,magnesium sulfate 0.6 g/L,manganese sulfate 0.3 g/L,potassium chloride 0.3 g/L,tween-80 1 mL/L.And the other medium components were invariable.Under this condition,the inhib⁃itory zone diameter was 23.05 mm.It was improved 10%than that before optimization.Moreover,the inhibitory spectrum of antifungal compound produced by ALAC-4 was wide.

Lactobacillus；antifungal substance；optimization medium；inhibitory spectrum

Q93-33

A

1001-2230（2017）08-0022-04

2017-02-13

内蒙古自然基金（2015MS0364）；国家自然基金（31260390）。

李晓婷（1991-），女，硕士研究生，从事食品微生物及发酵工程研究。

陈忠军