磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白在帕金森病模型大鼠黑质区的表达①

2017-09-29胡馨月刘斌徐佳莉张晋霞

中国康复理论与实践 2017年9期

胡馨月，刘斌，徐佳莉，张晋霞

胡馨月，刘斌，徐佳莉，张晋霞

目的观察磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白在帕金森病模型大鼠黑质区的表达及变化情况。方法 96只健康Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组、模型组、PI3K抑制剂LY294002组及p-mTOR抑制剂雷帕霉素组，每组又分为模型制备成功后4 d和8 d两个亚组，每个亚组12只。后三组颈背部皮下注射鱼藤酮制作帕金森病大鼠模型，相应时间点免疫组化及Western blotting检测大鼠黑质区PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达。结果与假手术组比较，模型组各时间点PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达增加(P＜0.05)，8 d亚组高于4 d亚组(P＜0.05)。与模型组比较，LY294002组各时间点p-Akt、p-mTOR蛋白表达减少(P＜0.05)，PI3K蛋白表达无明显变化(P＞0.05)；雷帕霉素组各时间点p-mTOR蛋白表达下降(P＜0.05)，PI3K、p-Akt蛋白表达无明显变化(P＞0.05)。结论黑质PI3K/Akt/mTOR信号通路激活可能是帕金森病发生、发展的重要机制之一。

帕金森病；磷脂酰肌醇3激酶；蛋白激酶B；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；黑质；大鼠

帕金森病是好发于中老年人的慢性神经系统退行性疾病，发病率逐年增加，主要病理改变是黑质致密部多巴胺能神经元变性和缺失[1]，病因及确切的发病机制尚未明确。近年研究发现，帕金森病与细胞自噬关系密切[2-6]。

磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,又称Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是体内蛋白质合成的重要信号通路，在自噬中发挥重要调节作用[7]。PI3K是一种存在于细胞质的复合体，在多种生长因子刺激下可被激活，是信号通路的重要组成分子。Akt是由480个氨基酸残基组成的蛋白质，是PI3K下游蛋白的关键分子，在该信号传导通路中起关键作用。mTOR是一种含有2549个氨基酸残基的蛋白分子，为Akt下游底物。p-Akt和p-mTOR是Akt及mTOR的活化形式。本研究检测PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白PI3K、p-Akt和p-mTOR在帕金森病模型大鼠黑质区的表达，探讨其在帕金森病发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康雄性Sprague-Dawley大鼠96只，体质量250～300 g，由中国人民解放军军事医学科学院提供，合格证号SCXK-(军)2014-0001。在华北理工大学屏障环境动物实验室自由喂养，室温(23±2)℃，自然光照，适应喂养2周。

将大鼠编号，用随机数生成器随机抽取不同数字，将大鼠随机分为假手术组、帕金森病模型组(模型组)、PI3K抑制剂2-(4-吗啉基)-8-苯基-4氢1苯并吡喃-4-酮(LY294002)组及mTOR抑制剂雷帕霉素组，每组又分为模型制备成功后4 d和8 d两个亚组，每个亚组12只。

1.2 主要试剂及仪器

鱼藤酮、葵花油：北京博奥森生物工程有限公司。PI3K、p-Akt及p-mTOR兔抗鼠多克隆抗体：ARIGO公司。免疫组化检测试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司。EG1150 H型组织包埋机：LEICA公司。BX53全自动显微镜扫描系统：OLYMPUS公司。

1.3 侧脑室注射

LY294002组10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉后，将鼠头固定于立体定向仪上，切开头皮，分离皮下组织，10%H2O2擦试颅骨，充分暴露前囟“十”字交叉骨性结构。在前囟点旁开0.9 mm，向后1.5 mm，用微型牙科钻打孔，有明显穿透感后拔出，到达硬脑膜表面。微量进样器抽吸10 mmol/L LY294002溶液10µl，沿钻孔缓慢进针，深3.8 mm，在5 min内匀速缓慢注完，留针5 min后缓慢拔针。

雷帕霉素组同法注射8 ng/µl雷帕霉素4µl。

模型组和假手术组同法注射等体积生理盐水。

1.4 模型制备

侧脑室注射后，采用颈背部皮下注射鱼藤酮制备帕金森病大鼠模型[8]。鱼藤酮以葵花油配制成2 mg/ml乳液，充分震荡混匀后避光保存。模型组、LY294002组及雷帕霉素组大鼠称体质量后，每只大鼠每天予鱼藤酮2 mg/kg颈背部皮下注射；假手术组每天颈背部皮下注射等量葵花油，直至出现行为学改变造模成功[9]后停止注射。选择评分2～6分者为实验大鼠。

术中大鼠肛温维持36.5～37.5℃。术后连续腹腔注射庆大霉素1万U/kg，共3 d，预防感染。

1.5 免疫组化染色

造模成功后4 d和8 d，各组分别取6只大鼠，10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉。剑突下横切口约2～3 cm，向上剪断3根肋骨，暴露心脏；剪开右心耳，经心脏灌注4℃生理盐水100～200 ml至肝脏完全变白，灌注4%多聚甲醛150～200 ml，至大鼠肝脏变硬、肢体僵直。迅速断头取脑组织，4%多聚甲醛中固定过夜。按《大鼠脑立体定位图谱》[10]取大鼠黑质区，常规脱水，石蜡包埋。连续切片，厚4 μm，捞片后60℃烤箱烘干2.5 h。

切片脱蜡至水，3%H2O2常温孵育10 min，灭活内源性过氧化物酶。加0.01 mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH=6.0)，微波煮沸10 min，冷却至室温。羊血清封闭，室温孵育10 min。加入PI3K(1∶300)、p-Akt(1∶400)、p-mTOR(1∶200)一抗，4℃冰箱过夜；加入生物素化二抗，37℃孵育30 min。加入辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素溶液，室温孵育15 min。DAB显色，苏木素复染。常规脱水，透明，干燥，封片。光镜下，以细胞质或核出现黄色或棕黄色颗粒样物质为阳性。高倍镜下观察各组大鼠黑质区不重叠的6个视野，行PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白阳性细胞计数，取平均值。

1.6 Western blotting

各级其余6只大鼠，10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉。断头后于冰上开颅取脑，冷PBS漂洗残余血，立即分离出新鲜纹状体，将蛋白酶抑制剂PMSF 4µl加入冷RIPA组织裂解液1 ml中，混匀，冰上备用。取脑组织标本加入含PMSF的裂解液中，体积比1∶3混合，匀浆器充分匀浆，冰上裂解40 min；4℃、12,000 r/min离心15 min。取上清，转移到另一离心管中，-80℃保存备用。

取蛋白样品每个泳道50µg，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸铵凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分离后，半干转法电转移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上，转移缓冲液甘氨酸5.8 g、Tris 2.9 g、SDS 0.37 g，重蒸馏水800 ml溶解后加入甲醇200 ml。PVDF膜封闭液中封闭，加入PI3K、p-Akt、p-mTOR一抗(1∶1000)4℃孵育过夜。PBS洗膜，加入羊抗兔二抗(1∶2000)，37℃ 1 h；洗膜。ECL显色，胶片曝光显影。采用Image J软件分析目的蛋白条带与内参蛋白β-action的相对光密度(OD)。

1.7 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析。数据以(xˉ±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 免疫组化

与假手术组比较，模型组各时间点PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达增加(P＜0.05)，8 d组高于4 d组(P＜0.05)。与模型组比较，LY294002组各时间点p-Akt、p-mTOR蛋白表达减少(P＜0.05)，PI3K蛋白表达无显著性差异(P＞0.05)；雷帕霉素组各时间点p-mTOR蛋白表达下降(P＜0.05)，PI3K、p-Akt蛋白表达无显著性差异(P＞0.05)。见表1～表3，图1～图3。

2.2 Western blotting

表1 各组造模后4 d、8 d免疫组化PI3K表达(/高倍视野)

表2 各组造模后4 d、8 d免疫组化p-Akt表达(/高倍视野)

表3 各组造模后4 d、8 d免疫组化p-mTOR表达(/高倍视野)

表4 各组造模后4 d、8 d Western blotting PI3K表达(OD)

图1 各组各时间点PI3K表达(免疫组化染色，bar=20 μm)

图2 各组各时间点p-Akt表达(免疫组化染色，bar=20 μm)

图3 各组各时间点p-mTOR表达(免疫组化染色，bar=20 μm)

图4 各组各时间点PI3K、p-Akt和p-mTOR表达(Western blotting)

表5 各组造模后4 d、8 d Western blotting p-Akt表达(OD)

表6 各组造模后4 d、8 d Western blotting p-mTOR表达(OD)

3 讨论

帕金森病的病因及确切的发病机制尚未明确，可能与年龄、遗传、环境、细胞凋亡、自噬、氧化应激、线粒体功能衰竭、钙超载、兴奋性氨基酸毒性等有关[1,11-13]。自噬在帕金森病的发生、发展过程中起重要作用[2-6]。自噬受多种信号通路的调控，PI3K/Akt/mTOR信号通路是其中重要信号调控通路[14]。

PI3K是真核生物细胞膜的组成部分，可以磷酸化肌醇磷脂肌醇环上的3'-OH，其家族包括许多脂质激酶；激活的PI3K可促进细胞存活，抑制凋亡[15]。Akt作为PI3K的主要底物之一，参与神经细胞的迁移、存活等过程，并对神经元大小具有调节作用。mTOR广泛存在于细胞质内，主要依据细胞营养状态调节信号，控制下游与翻译、转录等有关的多种蛋白的磷酸化，在细胞生存、生长和增殖中起调控作用。Akt是PI3K下游直接靶点蛋白，受上游PI3K的激活、磷酸化；活化的Akt可以直接激活mTOR，进而作用于下游靶蛋白，调控mRNA翻译效率，从而增加一系列与细胞生长、分化相关的蛋白表达[7,16-17]。

PI3K/Akt/mTOR信号通路在神经元的发育、生存和功能方面十分重要，多种基因/蛋白参与帕金森病的发病，直接影响中脑黑质多巴胺含量[18-19]。该信号通路也参与细胞自噬和分解异常蛋白，在对抗神经退行性疾病神经元凋亡中发挥重要作用[20]。本研究显示，帕金森病模型大鼠黑质区高表达PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白，提示PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白在帕金森病发病过程中发挥了重要作用。这与Khwanraj等[21]的研究结果基本一致。

LY294002是一种人工合成的PI3K特异性抑制剂，可靶向抑制PI3K催化P110亚基的活化，从而抑制下游底物[22]。雷帕霉素是大环内酯类抗生素，靶向抑制mTOR活性，调节线粒体功能，延长时序寿命，减少神经元凋亡[23-24]。赵明明等[25]在神经元机械性损伤中，Western blotting发现造模后3 h Akt达高峰，应用LY294002干预后Akt明显降低。Malagelada等[26]报道，雷帕霉素可以减少6-羟多巴对PC12细胞的毒性，并增加1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶诱导的帕金森病小鼠黑质中多巴胺能神经元存活。本研究显示，应用LY294002及雷帕霉素特异性抑制剂阻断该通路后，帕金森病模型大鼠黑质区相应时间点p-Akt和p-mTOR蛋白阳性表达减少。

综上所述，PI3K/Akt/mTOR信号通路在帕金森病中过度表达，可能在帕金森病的发生、发展中起重要作用。使用此通路的抑制剂可能会对控制帕金森病的进展产生积极影响，可能为帕金森病的治疗提供新的干预靶点。

[1]中华医学会神经病学分会帕金森病及运动障碍学组.中国帕金森病治疗指南(第三版)[J].中华神经科杂志,2014,47(6):428-433.

[2]Yang Q,Mao Z.Parkinson disease:a role for autophagy?[J].Neuroscientist,2010,16(4):335-341.

[3]Liu B,Sun J,Zhang J,et al.Autophagy-related protein expression in the substantia nigra and eldepryl intervention in rat models of Parkinson's disease[J].Brain Res,2015,1625:180-188.

[4]刘斌,孙静,张晋霞,等.自噬及自噬相关蛋白在帕金森病模型大鼠黑质纹状体中的表达及意义[J].中国神经免疫学和神经病学杂志,2014,21(3):187-191.

[5]刘斌,孙静,张晋霞,等.咪多吡对帕金森病模型大鼠黑质纹状体自噬及自噬相关蛋白表达的影响[J].中国神经精神疾病杂志,2014,40(9):522-526.

[6]贾玉凤,吴庆文,程月发,等.丁苯酞对1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导细胞自噬的影响[J].中国康复理论与实践,2016,22(4):422-427.

[7]王一超,刘斌,毛文静,等.靶蛋白信号通路相关蛋白在血管性痴呆大鼠海马CA1区的表达[J].中华老年心脑血管病杂志,2015,17(8):864-867.

[8]常宇涛,罗晓光,任艳,等.鱼藤酮损伤大鼠黑质至行为学及黑质多巴胺能神经元损伤[J].解剖科学进展,2011,17(1):60-62.

[9]陈忻,张楠,赵晖,等.鱼藤酮致帕金森病大鼠行为学与黑质病理损伤的关系[J].中国神经精神疾病杂志,2008,34(4):232-234.

[10]包新民,舒斯云.大鼠脑立体定位图谱[M].北京:人民卫生出版社,1990:25-28.

[11]王涛,纪超,黎青,等.帕金森病模型大鼠纹状体内氧化应激与细胞凋亡蛋白的表达[J].中国康复理论与实践,2009,15(5):431-433.

[12]袁廷伟,孙芳玲,蒋莹,等.炎症在帕金森病中的作用[J].中国康复理论与实践,2013,19(7):640-644.

[13]陈旭,耿翔.帕金森病发病机制新进展[J].中华老年心脑血管病杂志,2014,16(9):897-898.

[14]王和峰,翟纯刚,李继福,等.PI3K/Akt/mTOR信号通路在巨噬细胞自噬及动脉粥样硬化斑块不稳定中的作用[J].中国病理生理杂志,2013,29(3):390-397.

[15]Zhao Y,Zhang Q,Xi J,et al.Neuroprotective effect of fasudil on inflammation through PI3K/Akt and Wnt/β-catenin dependent pathways in a mice model of Parkinson's disease[J].Clin Exp Pathol,2015,8(3):2354-2364.

[16]周福安,古丽那尔·阿布拉江,张志明,等.PI3K/AKT/mTOR信号转导通路相关蛋白在脑胶质瘤中的表达及临床意义[J].临床神经病学杂志,2012,25(4):278-281.

[17]翟纯刚,季晓平,王和峰,等.抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路对兔原代巨噬细胞自体吞噬的影响及机制[J].中国动脉硬化杂志,2014,22(1):7-12.

[18]Timmons S,Coakley MF,MoloneyAM,et al.Akt signal transduction dysfunction in Parkinson's disease[J].Neurosci Lett,2009,467(1):30-35.

[19]郭旭堂,梁健芬,张新博.PI3K/Akt/mTOR信号通路与帕金森病关系的研究进展[J].现代医药卫生,2015,31(7):1019-1021.

[20]姜凌,常诚.自噬与神经退行性疾病[J].卒中与神经疾病,2014,21(2):125-128.

[21]Khwanraj K,Madlah S,Grataitong K,et al.Comparative mRNA expression of eEF1A isoforms and a PI3K/Akt/mTOR pathway in a cellular model of Parkinson's disease[J].Parkinsons Dis,2016,2016:8716016.

[22]Yang CM,Lin MI,Hsieh HL,et al.Bradkin in-induced p42/p44MAPK phosphorylation and cell proliferation via Src,EGF receptors,and PI3K/Akt in vascular smooth musclecells[J].J Cell Physiol,2005,203(3):538-546.

[23]Bastidas RJ,Shertz CA,Lee SC,et al.Rapamycin exerts antifungal activity in vitro and in vivo against Mucor circinelloides via TKBP12-dependent inhibition of Tor[J].Eukaryot Cell,2012,11(3):270-281.

[24]McCormick MA,Tsai SY,Kennedy BK.TOR and ageing:a complex pathway for a complex process[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,2011,366(1561):17-27.

[25]赵明明,赵永博,罗鹏,等.PI3K/Akt信号通路对神经元机械性损伤诱导的自噬调节作用[J].中华神经外科疾病研究杂志,2012,11(6):491-494.

[26]Malagelada C,Jin ZH,Jackson-Lewis V,et al.Rapamycin protects against neuron death in in vitro and in vivo models of Parkinson's disease[J].J Neurosci,2010,30(3):1166-1175.

Expression of Phosphatidylinositol 3-Kinase,Protein Kinase B and Mammalian Target of Rapamycin in Substantia Nigra in Rats with Parkinson's Disease

HU Xin-yue,LIU Bin,XU Jia-li,ZHANG Jin-xia
First Department of Neurology,the Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063000,China

LIU Bin.E-mail:liubintsh@126.com

Objective To observe the expression of phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K)/protein kinase B(Akt)/mammalian target of rapamycin(mTOR)signaling pathway in substantia nigra in rats with Parkinson's disease(PD).Methods A total of 96 Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group,model group,PI3K inhibitor LY294002 group and mTOR inhibitor rapamycin group.Each group was divided into 4 days and 8 days subgroups after the model.PD model was established by injecting rotenone subcutaneously.The expression of PI3K,p-Akt and p-mTOR in substantia nigra was detected with immunohistochemistry and Western blotting.Results Compared with the sham group,the expression of PI3K,p-Akt and p-mTOR increased in the model group(P＜0.05),and was more in 8 days subgroup than in 4 days subgroup(P＜0.05).Compared with the model group,the expression of p-Akt and p-mTOR reduced in the LY294002 group(P＜0.05),while the expression of PI3K varied little(P＞0.05);the expression of p-mTOR decreased in the rapamycin group(P＜0.05),while the expression of PI3K and p-Akt varied little(P＞0.05).Conclusion PI3K/Akt/mTOR signaling pathway is over activated in substantia nigra in rats with Parkinson's disease,which may play an important role in occurrence and development of the disease.

Parkinson's disease;phosphatidylinositol 3-kinase;protein kinase B;mammalian target of rapamycin;substantia nigra;rats

R742.5

1006-9771(2017)09-1043-08

2017-01-10

2017-04-01)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.09.011

[本文著录格式] 胡馨月，刘斌，徐佳莉，等.磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白在帕金森病模型大鼠黑质区的表达[J].中国康复理论与实践,2017,23(9):1043-1050.

CITED AS:Hu XY,Liu B,Xu JL,et al.Expression of phosphatidylinositol 3-kinase,protein kinase B and mammalian target of rapamycin in substantia nigra in rats with Parkinson's disease[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(9):1043-1050.

河北省医学科学研究重点课题(No.20130064)。

华北理工大学附属医院神经内一科，河北唐山市063000。作者简介：胡馨月(1989-)，女，汉族，河北承德市人，硕士研究生，医师，主要研究方向：帕金森病及相关疾病。通讯作者：刘斌，男，硕士，主任医师，教授，研究生导师。E-mail:liubintsh@126.com。