益气活血组方对急性心梗模型大鼠SDF-1、CXCR4、VEGF变化的影响*

李伟钦

（四川省乐山市人民医院，四川 乐山 614000）

益气活血组方对急性心梗模型大鼠SDF-1、CXCR4、VEGF变化的影响*

李伟钦

（四川省乐山市人民医院，四川 乐山 614000）

目的 观察益气活血组方对AMI大鼠缺血区心肌组织SDF-1、CXCR4、VEGF含量变化的影响。方法80只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、麝香保心丸组和益气活血组方组，每组20只。根据处死时间再将各组分为3 d，7 d，14 d 3个时相组；药物干预后通过聚合酶链式反应（PCR）检测大鼠心肌组织SDF-1、CXCR4、VEGFmRNA 的表达；Western-blot法检测大鼠心肌组织 SDF-1、CXCR4、VEGF 蛋白的表达。结果 麝香保心丸和益气活血组方表达SDF-1/CXCR4 mRNA水平均与假手术组、对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），麝香保心丸与益气活血方比较，其表达SDF-1/CXCR4 mRNA水平差别不大（P>0.05）。麝香保心丸组表达CXCR4 mRNA水平高于益气活血组方组（P<0.05）。益气活血组方组、麝香保心丸干预组较假手术组和模型组的CXCR4和SDF-1蛋白表达量明显增高（P<0.05）。结论 益气活血组方对急性心肌梗死模型大鼠有较好的治疗作用，其作用机理可能是通过增加VEGF和CXCR4、SDF-1来发挥促进毛细血管新生、EPCs动员和趋化的作用。

急性心梗大鼠 益气活血组方 血管新生 EPCs动员

冠状动脉粥样硬化性心脏病（CHD），简称冠心病，是由多种原因导致冠状动脉老化，从而导致其狭窄，栓塞，进而造成心肌缺血缺氧的一种心脏病［1］。近年来，医学界提出的“治疗性血管新生”概念［2］。血管新生是血管稳态的关键特点，它是指通过促进缺血心肌血管的生成，从而建立侧支循环，进而有效恢复缺血心肌血供。既往研究表明，益气活血组方单药及复方具有促进局部血管新生，从而增加心脏侧支循环，延缓心肌缺血的作用［3］。血管内皮生长因子（VEGF）具有强烈的促进毛细血管新生的作用，而与毛细血管新生的重要环节是EPCs的动员、趋化，这个过程主要集中在SDF-1的活化及与其相关的上下游分子调节。本研究提出猜想，益气活血组方促进缺血性心肌损伤毛细血管新生机理可能与调节基质细胞衍生因子（SDF-1）的活化及其相关的趋化因子受体4（CXCR4）、VEGF表达有较大关系。因此本研究采用AMI模型大鼠探讨该方对SDF-1、CXCR4、VEGF变化的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级SD大鼠 25只，雄性，8～10周龄，体质量（280±20）g，购自斯莱克景达实验动物公司，饲养于湖南中医药大学SPF级实验动物中心［动物许可证号 SYXK（湘）2013-0005］。

1.2 药物与试剂 益气活血组方灌胃液按60 kg成人每日所需服用的益气活血组方剂量如下：黄芪50 g，当归10 g，川芎25 g，丹参25 g。均购于湖南中医药大学第一附属医院，经鉴定为道地药材。麝香保心丸灌胃液按60 kg成人每日所需服用的麝香保心丸剂量为18 g，于正规药店购买麝香保心丸（国药准字Z31020068；规格22.5 mg/丸，42丸/瓶；上海和黄药业有限公司生产）。DAB显色试剂盒，购自博士德生物公司（武汉）；兔抗大鼠单克隆抗体VEGFR-2-FITC、兔抗大鼠单克隆抗体Sca-1–PE均购自SIGMA公司（美国）；聚合酶链反应（PCR）试剂盒购自 Promega公司（美国）；BCA蛋白定量试剂盒购自博士德生物公司（武汉）；蛋白提取试剂盒购自凯基生物有限公司（南京）。

1.3 主要仪器与设备 Du-640核算蛋白分析仪购自贝克曼库尔特公司（美国）；PCR基因扩增仪购自Bio-Rad公司（美国）；酶标仪购自赛默飞世尔公司（上海）；转膜仪购自天能科技有限公司（上海）；图像分析软件Image-Pro Plus 6.0购自 Olympus公司 （日本）；Du-640核算蛋白分析仪购自贝克曼库尔特公司（美国）。1.4 造模与分组 将80只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组（20只）、模型制备组（60只）两组。模型制备组再次按照随机数字表法将分为模型组、麝香保心丸组和益气活血组方组，每组20只。造模方法：1）将小鼠以10%水合氯醛腹腔注射（40 mg/kg）麻醉，麻醉满意后置于手术台；2）四肢及头部仰卧固定于手术台上，四肢皮下连接心电图电极，记录标准Ⅱ导联心电图，小鼠颈部及左腋下脱毛颈部和左前胸的皮肤备皮消毒；3）胸骨上窝上正中切开皮肤0.5 cm，向上钝性分离推开下颌下腺，剪除气管前肌肉，使气管在没有任何拉钩牵引的情况下能充分显露，彻底止血后于第2～3气管环间行气管横行切开，注意不要切断气管软骨环，切口长度不超过气管周径1/3，擦干其内分泌物后插入气管插管（用小儿吸痰管自制），深度为0.5～1 cm。连接空气呼吸机进行人工控制呼吸，（流量4～6 mL/100 g，呼吸频率 80～90 min，呼吸预设比 1∶1）同时观察胸廓起伏，呼吸支持建立成功的标志是胸廓的起伏要与呼吸机工作频率保持一致，且声音顺畅无阻塞感；4）在确定自主呼吸和呼吸机频率一致后，进行左前胸消毒铺巾，顺肋间隙方向于胸骨左旁第3～4肋间切开皮肤，长约1 cm，逐层分离皮下组织、肌肉，于2～3肋骨间撑开进胸，向右上方推开胸腺，可暴露心脏及大血管根部，切开心包，轻挤大鼠胸廓，将心脏挤出，有部分动物在左心耳下缘与肺动脉圆锥间可以看见左冠脉前降支起始部，用6-0可吸收缝合线结扎血管缝针，进针深度控制在0.1 cm，宽度为0.1～0.2 cm；观察打结位置是否准确，造模成功的评判标志为肉眼可见打结处周围及以下心肌变白，跳动减弱，心电图示ST段或T段抬高；5）彻底止血后逐层关胸。关胸过程中于切口内放置排气管（用小儿头皮针的软管自制），关胸毕，抽空胸腔积气后拨除。恢复大鼠自主呼吸，拨出气管内插管，清除气管内分泌物，气管切口不作缝合。颈部使用4-0号手术线缝合；6）手术过程中分别在开胸后、缝针后、结扎后和关胸后4个点记录心电图变化；7）考虑使用水合氯醛麻醉后容易导致大鼠体温降低，采用37℃恒温塾保暖，并采取俯卧位帮助大鼠排痰，并轻柔按压其胸部，帮助脱离呼吸机的大鼠恢复自主呼吸，腹腔注射青霉素（8万 U/只，连续 3 d）抗感染；8）假手术组大鼠除在相应位置穿线不接扎外，控制其于其他组在手术流程和时间上保持相同。

1.5 给药方法 于术后24 h灌胃给药，每日1次，连续14 d。假手术组、模型组予等体积蒸馏水灌胃，麝香保心丸组予麝香保心丸 （浓度按照60 kg体质量的成人每日剂量为18 g换算成大鼠的剂量并溶于等体积蒸馏水），益气活血组方组（浓度按照60 kg体质量的成人每日剂量为原方粉碎化后100 g，换算成大鼠的剂量并溶于等体积蒸馏水灌胃）。末次给药后禁食24 h，不禁水，予颈髓离断法处死后，立即开胸，留心脏标本。因术后大鼠死亡及取材时标本筛选，最后每组取6个心脏标本用于指标检测。

1.6 检测指标 1）RT-PCR对大鼠心肌组织SDF-1、CXCR4、VEGF、mRNA 表达的测定 （1）心肌细胞组织液的制备收集各组实验动物的心脏组织，使用生理盐水清洗3遍，洗去红细胞和各种组织液。然后在吸水纸上吸干水分，称质量并记录。将新鲜心脏组织放于研钵中，倾倒入液氮，在液氮作用下，心脏组织快速结冰，然后用力碾磨，将心脏组织制备成组织液。研磨过程中一定要及时添加液氮，边研磨边添加，在液氮没有挥发尽时就应该添加。将研钵放在大小合适的泡沫盒里面研磨，这样可以保温，减小液氮挥发的速度。研磨成粉末后，在液氮挥发尽后，应立即加入裂解溶液（裂解溶液含有抗氧化剂，防止DNA被氧化降解。使用的抗氧化剂有PVP，b-巯基乙醇）。裂解液加入后，会冻成冰块，可以继续研磨，直至融化成液态。（2）核酸提取采用RT-PCR法检测造模后不同时点大鼠缺血心肌组织SDF-1、CXCR4、VEGF表达情况。应用TRIZOL试剂盒提取总RNA，以紫外分光光度计A280、A260定量测定浓度；将总RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见明显的28S、18 S两条区带，证明其完整性。利用NCBI数据库分别查询大鼠SDF-1、CXCR4、VEGF和作为内参基因的三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）序列，通过Primer Premier 5.0引物设计软件引物序列，如表1。将标本mRNA逆转为cDNA后进行PCR扩增反应。用SYBR法进行实时定量 PCR。 采用 2-ΔΔCt法，以 2-ΔΔCt值反映目的基因表达水平，其数值越大，表达越强。2）Western Blotting 检测大鼠心肌 SDF-1、CXCR4、VEGF蛋白表达水平：剪取约0.5 mg组织置于匀浆器中，加入1 mL总蛋白提取液（RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂）匀浆，低温下超声细胞破碎仪裂解3次，每次3 s，将匀浆液吸出放到1.5 mL离心管中，9000 r/min离心10 min后取上清液。 将样品体积：5×loading buffer体积=5∶1，拌匀，于100℃条件下加热3 min，使蛋白质变性。BCA法定量20 μg蛋白，经10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，通过电转仪将蛋白转移至NC膜。电转结束后，将电转膜置于37℃下5%的脱脂奶粉（PBS配制）中封闭2 h。封闭的膜用PBST漂洗2～3次，切下膜条（3～5 mm宽左右）按顺序置于加样槽中，分别加入一抗约1 mL（按照体积比为1∶1000稀释），室温下于摇床孵育2 h。弃去一抗，每个加样槽加2～3 mL PBST，摇床洗涤5～10 min，加入二抗1 mL 4℃过夜。每条膜加入适量的发光底物试剂，以浸润膜条为宜，尽快行化学发光，得到胶片。阳性条带以Gel pro4.0版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD累积光密度参考值。

表1 引物序列表

1.7 统计学处理 应用SPSS19.0统计学软件。计量资料以（±s）表示。组内不同时间点的均数比较采用单因素方差（ANOVA）分析，其中3组以上两两比较在方差齐性时采用SNK检验，方差不齐时采用Dunnett-T3检验。同一时间点的组间的均数比较采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 实时荧光定量RT-PCR结果 见表2。1）益气活血组方对VEGF mRNA的影响：麝香保心丸和益气活血组方表达VEGF mRNA水平均与假手术组、对照组比较有显著性差异（P<0.01），麝香保心丸和益气活血组方表VEGF mRNA水平差别不大（P>0.05），结果说明，益气活血组方的功效与麝香保心丸功效相似，但较优于麝香保心丸。2）益气活血组方对SDF-1/CXCR4 mRNA的影响：麝香保心丸和益气活血组方表达SDF-1/CXCR4 mRNA水平均与假手术组、对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），麝香保心丸与益气活血方比较，其表达SDF-1/CXCR4 mRNA水平无明显差异（P>0.05）。麝香保心丸组表达CXCR4 mRNA水平高于益气活血组方组（P<0.05）。

表2 各组VEGF mRNA及SDF-1/CXCR4 mRNA的表达水平

表2 各组VEGF mRNA及SDF-1/CXCR4 mRNA的表达水平

与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组较，△P＜0.05。下同。

组 别 n CXCR4 VEGF SDF-1假手术组 15 0.002±0.001模型组 15 0.004±0.002麝香保心丸组 15 0.009±0.002*△1.28±0.34 0.007±0.002 0.98±0.23 0.012±0.001 3.10±0.43*△ 0.033±0.003*△益气活血方组 15 0.007±0.001*△5.45±0.42*△ 0.028±0.004*△

2.2 Western Blot结果 见图1，表3。1）益气活血组方对VEGF蛋白表达的影响：麝香保心丸和益气活血组方均能增加心梗边缘区VEGF蛋白表达，且与假手术组，模型组比较差异具有统计学意义（P<0.01）；麝香保心丸和益气活血组方表VEGF蛋白表达水平差别不大（P>0.05）。2）益气活血组方对SDF-1/CXCR4蛋白表达的影响：益气活血组方组、麝香保心丸干预组的SDF-1/CXCR4蛋白表达量明显升高，麝香保心丸和益气活血组方表达SDF-1/CXCR4蛋白水平均与假手术组、对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）；麝香保心丸组表达CXCR4蛋白水平高于益气活血方组（P>0.05）。

图1 分子蛋白免疫印迹法（WB）检测各组对VEGF以及SDF-1/CXCR4蛋白表达

表3 各组对VEGF及SDF-1/CXCR4 mRNA蛋白表达情况

表3 各组对VEGF及SDF-1/CXCR4 mRNA蛋白表达情况

组 别 n CXCR4 VEGF SDF-1假手术组 15 0.03±0.001模型组 15 0.04±0.002麝香保心丸组 15 0.05±0.002*△1.28±0.34 0.04±0.002 0.98±0.23 0.05±0.001 3.10±0.43*△ 0.06±0.003*△益气活血方组 15 0.04±0.004*△5.45±0.42*△ 0.05±0.002*△

3 讨 论

3.1 内皮祖细胞的动员 EPCs是成熟血管内皮细胞的前体细胞，属于干细胞群体。出生后EPCs主要存在于骨髓中，在正常的生理状态下，外周循环中EPCs数目很少。当机体遭受某种应激刺激后，骨髓中EPCs释放出来，向外周循环中迁移，增加外周血中EPCs的数量，这一过程成为EPCs的动员。

3.2 SDF-1/CXCR4对内皮祖细胞的调控作用 现已证实基质细胞衍生因子 （SDF）-1及趋化因子受体4（CXCR4）在EPCs的动员行为中起到了关键的作用，SDF-1是趋化因子蛋白家族中的一种小分子细胞因子，又被称为趋化因子12（CXCL12），是目前已知的最强大的趋化因子，对CD34+/CXCR4+细胞具有强大的趋化作用。CXCR4是SDF-1的高度特异性受体，SDF-1和CXCR4配对结合后，产生二级信使，发挥细胞迁徙、黏附、增殖、凋亡等多种功能，而且诱导细胞管样结构的形成［4］。大量研究证明SDF-1在损伤部位表达的增加是组织对损伤产生反应的体现，SDF-1/CXCR4在ECPs向损伤部位的迁移过程中发挥重要作用［5］。

3.3 VEGF与SDF-1/CXCR4 同时，VEGF也是血管发生及发育过程中重要的细胞因子，VEGF通过作用EPCs表面的两种受体VEGFR1和VEGFR2来诱导EPCs的增殖、调节黏附分子的表达从而实现对EPCs的动员，促使其增殖、分裂、移行、诱导新生血管的形成，同时它还可以组织新生血管内皮细胞的凋亡，上调EPCs的CXCR4的表达，增加ECPs对SDF-1的反应，这种正反馈作用进一步加速了新生血管的形成。在血管新生过程中，不仅可以出现SDF-1的高表达，VEGF的表达也明显升高，但SDF-1增高的比例明显高于VEGF；同时，SDF-1能够诱导ECPs和血管内皮细VEGF的表达，因此猜想SDF-1是VEGF的上游信号分子，而VEGF也同样能够诱导内皮细胞中SDF-1的表达［6］，SDF-1与 VEGF共同促进 EPCs的动员，从而促进缺血区血管的新生。

3.4 中医“祛瘀生新”理论与缺血区心肌血管生成的联系 有研究表明［7］，丹参、丹参黄芪药对等药物可以达到促进血管生成的目的，因此推测其机制可能便是通过促进SDF-1、CXCR4蛋白及mRNA表达水平，从而增加SDF-1、CXCR4的含量，最终得以促进新生血管的生成。胡国恒教授认为，这种促血管新生的概念可能会对阐明“祛瘀生新”中所谓“新”的微观物质基础意义重大。因此，推测益气活血组方改善心肌缺血、防治冠心病的机制之一有可能便是促血管新生。笔者前期实验研究也表明，本方延缓冠心病病情加重可能与其改善或者逆转心肌缺血，通过上调Ang-1的表达、抑制Ang-2的表达，促进局部血管新生，从而增加心脏侧支循环，达到延缓心肌缺血的目的有关［8］。同时，益气活血组方既往研究也表明，该方能使大鼠心肌梗面积明显减少，同时能够促进缺血心肌血管新生，而促进HGF的表达可能与其机制有关［9］。同时，在研究过程中也有多项证据表明益气活血组方具有促进VEGF表达，加强血管内皮细胞有丝分裂，从而促进血管新生的作用。基于VEGF具有强烈的促进毛细血管新生的作用，而与毛细血管新生的重要环节是EPCs的动员、趋化，这个过程主要集中在SDF-1的活化及与其相关的上下游分子调节。因此本研究提出猜想，益气活血组方促进缺血性心肌损伤毛细血管新生机理可能与调节SDF-1的活化及其相关的CXCR4、VEGF表达有较大关系，所以设计本课题的相关检测项目以验证上述现象。通过这一系列研究可以深入揭示中医药通过促进EPCs动员，从而促进血管新生、侧支循环重建，发挥治疗缺血性心肌梗死的作用［10-12］。3.5 本实验结果

3.5.1 应用实时荧光定量RT-PCR 现益气活血组方组、麝香保心丸干预组较假手术组和模型组的CXCR4和SDF-1 mRNA表达量明显增高。

3.5.2 应用Western Blot方法 灌胃1周后Western blot条带经过ECL化学发光技术显影后，进行灰度分析。发现益气活血组方组、麝香保心丸干预组的VEGF和CXCR4蛋白表达量明显升高，而假手术组和模型组的CXCR4和SDF-1蛋白表达量没有明显变化。提示VEGF和CXCR4、SDF-1蛋白的表达与心肌细胞的再生具有相关性。

综合上述结果，笔者推测麝香保心丸与益气活血组方均能增加VEGF和CXCR4、SDF-1蛋白和基因的表达。通过测定VEGF和CXCR4、SDF-1基因和蛋白的表达，发现麝香保心丸与益气活血组方均能上调VEGF和CXCR4、SDF-1蛋白和基因的表达水平。那么笔者推测益气活血组方对内皮祖细胞的可能作用机制可能与上调SDF-1/CXCR4、VEGF因子的表达有关。VEGF和CXCR4、SDF-1可以作为研究益气活血组方动员EPCs促进缺血区心肌血管新生的靶点［13-15］。

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Effect of Yiqi Huoxue Decoction on the Change of SDF-1，CXCR4 and VEGF in Model Rats with Acute Myocardial Infarction

LI Weiqin. Leshan Hospital of Traditional Chinese Medicine of Sichuan Province，

Sichuan，Leshan 614000，China.

Objective： To explore the effect of Yiqi Huoxue Decoction on the change of SDF-1，CXCR4 and VEGF of myocardial tissue in ischemic zone of AMI rats.Methods：80 SD rats were divided into the sham operation group，the model group，Shexiang Baoxin Decoction group and Yiqi Huoxue Decoction group by random number table，20 rats in each group.According to the execution time，each group was divided into three phase group： 3 d，7 d and 14 d.After the intervention of the drugs，mRNA expression of SDF-1，CXCR4 and VEGF in myocardial tissue of the rat was detected by polymerase chain reaction （PCR）.The protein expression of SDF-1，CXCR4，VEGF in myocardial tissue of the rat was detected by Western-blot.Results： Compared with the sham operation group and the control group，mRNA levels of SDF-1/CXCR4 expression in Shexiang Baoxin Decoction group and Yiqi Huoxue Decoction group were statistically significant（P<0.05），but there was little difference between Shexiang Baoxin Decoction group and Yiqi Huoxue Decoction group （P>0.05）.mRNA level of CXCR4 expression in Shexiang Baoxin Decoction group was higher than that of Yiqi Huoxue Decoction group （P<0.05）.The protein expression of CXCR4 and SDF-1 in Shexiang Baoxin Decoction group and Yiqi Huoxue Decoction group was obviously higher than that of the sham operation group and the model group （P<0.05）.Conclusion：Yiqi Huoxue Decoction has a good therapeutic effect on rat model of acute myocardial infarction and its mechanism may be related to the increase of VEGF，CXCR4 and SDF-1 to play a role in promoting capillary regeneration，EPCs mobilization and chemotaxis.

Rats with acute myocardial infarction；Yiqi Huoxue Decoction；Angiogenesis；EPCs mobilization

R285.5

A

1004-745X（2017）09-1541-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.09.011

2016-05-14）

四川省卫计委课题（17PJ560）