“益气调血、扶本培元”药线灸对多发梗死性痴呆大鼠海马乙酰胆碱、乙酰胆碱酯酶、胆碱乙酰转移酶含量的影响

罗本华 罗梅桂 张亚飞 王 燕

(广西中医药大学，广西 南宁 530001)

“益气调血、扶本培元”药线灸对多发梗死性痴呆大鼠海马乙酰胆碱、乙酰胆碱酯酶、胆碱乙酰转移酶含量的影响

罗本华 罗梅桂1张亚飞2王 燕2

(广西中医药大学，广西 南宁 530001)

目的观察“益气调血、扶本培元”药线灸对多发梗死性痴呆(MID)大鼠海马乙酰胆碱(ACh)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、胆碱乙酰转移酶(ChAT)含量的影响。方法100只雄性大鼠经MID造模、痴呆筛选后，随机分为正常组、模型组、假手术组、药线灸组、药物组和药线非穴组6组，各组10只；药线灸组予壮医药线点灸治疗，药物组给予多奈哌齐口服治疗，药线非穴组给予针刺两肋下非穴点治疗，余3组未给予特别治疗。经4 w干预后处死动物，分离海马，匀浆、分离上清，检测ACh、AChE与ChAT含量。结果模型组ACh、ChAT含量较正常组显著降低，AChE含量显著升高(P<0.05)；药线穴组与模型组ACh、AChE无统计学差异(P>0.05)，药线灸组能显著升高ACh、ChAT和降低AChE含量，而药物组只显著升高ACh和降低AChE含量(P<0.05)；药物组与药线灸组比较无差异(P>0.05)。结论“益气调血、扶本培元”药线灸可以全面改善MID大鼠海马ACh代谢障碍，且较多奈哌齐有疗效优势。

药线灸；血管性痴呆(VD)；乙酰胆碱(ACh)；乙酰胆碱酯酶(AChE)；盐酸多奈哌齐

血管性痴呆(VD)以大脑认知功能损害为核心症状的一种慢性进行性疾病〔1〕，是痴呆的第二大原因〔2〕，也有报道是亚洲国家痴呆的首发原因〔3〕。研究表明针灸治疗VD具有疗效确切、安全、无毒副作用等优点〔4〕。本实验观察“益气调血、扶本培元”药线灸对多发梗死性痴呆(MID)大鼠海马乙酰胆碱(ACh)、乙酰胆碱酯酶(AChE)及胆碱乙酰转移酶(ChAT)含量的影响。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 健康SPF级Wistar雄性大鼠100只，体重(280±20)g，由广西医科大学动物实验中心提供；室温18～22℃，相对湿度45%，室内采光按照白昼循环模式，标准粒饲料定时喂养，自由饮水，适应性喂养15 d。大鼠AChE、ACh、ChAT酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒96T(武汉基因美生物科技有限公司)；水合氯醛AR250G(No.SHLQ-250)；盐酸多奈哌齐〔5 mg/片，卫材(中国)药业有限公司制造，国药准字H20050978〕，由广西中医药大学第一附属医院制剂室协助配成浓度为10%的药液。高速冷冻离心机(TGL-16M)，酶标仪(芬兰LabsystemsMultiskan MS公司)，洗板机(芬兰ThermoLabsystems公司)，微量高速离心机(国产)，HH.CP-01W隔水式恒温培养箱(国产)，PR0200电动玻璃匀浆仪(No.FLUKO)，Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所)。

1.2动物分组 采用随机数字表法将100只大鼠随机分为正常组10只、假手术组10只和预用栓子造模组80只；栓子造模组在经过Morris水迷宫筛选出痴呆鼠40只，随机分为模型组、药线灸组、药物组和药线非穴组，各组10只。

1.3MID造模方法〔5〕取同种大鼠股动脉采血，无菌条件下于37℃温箱内自然干燥24 h，用100目筛子过筛，制备200 μm以下的血凝块备用。应用时每10 mg血栓加0.3 ml生理盐水制成混悬液。3.5%水合氯醛按35 mg/100 g体重腹腔麻醉。颈正中切开皮肤(约1 cm)，剥离胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌与胸骨乳突肌，暴露颈外动脉，分离颈外动脉上两分支，避开两分支，分别在颈外动脉上备2根手术缝合线，结扎远心端，近心端先套一活结。用儿科4号头皮针针头逆行穿刺右颈外动脉至右颈内动脉起始处，随即用1 ml注射器缓慢(60～90 s)注入栓子盐水悬液0.3 ml，使栓子通过颈内动脉进入颅内至大脑各动脉，造成MID，然后结扎颈外动脉，缝合皮肤。切口处滴注庆大霉素抗感染。假手术组手术方法同模型制作，只是注射时以生理盐水0.3 ml代替栓子溶液。

1.4模型筛选 栓子造模组于造模后7 d进行Morris水迷宫隐蔽平台试验〔6〕，连续训练5 d，1次/d。取第5天正常组大鼠逃避潜伏期的均值为参考值，同时计算栓子造模组大鼠第5天的平均逃避潜伏期与参考值之差占该鼠的平均逃避潜伏期时间的比值，>20%定义为痴呆鼠。只有符合痴呆条件的动物才用于本课题MID模型。

1.5针刺干预方法及疗程 ①药线灸组：治则：益气调血，扶本培源。取穴：按“益气调血、扶本培元”针法取穴，即按照华兴邦动物穴位图谱，取膻中、中脘、气海及双侧血海、足三里。药线灸操作方法：按《壮医药线灸疗法》〔7〕采用2号药线(直径0.5 mm)，轻刺激手法点灸，按先上后下、先躯干再四肢、先阳后阴：次序点灸以上相应腧穴各1壮。②模型组：给予药线灸组相同时间、相同程度的捉抓刺激。③药线非穴组：选取双侧肋下2个固定非穴点，针刺双侧肋下各两个固定非穴点〔8〕，约相当于乳正中线外开2.5 mm肋弓下1 mm平行肋弓方向向外下斜刺3 mm；作为对照刺激点，轻刺激手法药线灸左3右4壮，或左4右3壮，交替。④假手术组：给予药线灸组相同时间、相同程度的捉抓刺激。⑤正常组：给予药线灸组相同时间、相同程度的捉抓刺激。⑥药物组：于造模并痴呆筛选后将1 mg·kg-1·d-1盐酸多奈哌齐溶于2 ml生理盐水中灌胃，于每日早晨8∶00灌胃。以上各组于模型筛选后开始按相应干预方法治疗，每日治疗1次，每周6次，共治4 w。

1.6大鼠海马取材方法 实验干预方案完成后，即断头处死动物，开颅迅速取出整个脑组织，在冰上分离各组大鼠海马组织，在冰冷生理盐水中洗去血液，在电子天平上称重后置于-80℃冰冻保存备用，行相关检测。

1.7ACh、AChE与ChAT含量测定 标本融化后保持6℃的温度备用，以0.1 g加0.9 ml磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4)比例加入PBS液，用超声匀浆器冰上将标本匀浆充分，离心5 min(3 000 r/min)，仔细收集上清，分装后待检测。采用双抗体夹心法检测ACh、AChE与ChAT含量；按ACh、AChE与ChAT相应试剂盒步骤进行检测。

1.8统计学方法 采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

模型组与正常组、假手术组比较，ACh含量显著降低，AChE显著增高(P<0.01)，而正常组与假手术组比较无差异(P>0.05)；药线非穴组与模型组ACh、AChE无统计学差异(P>0.05)；药物组、药线非穴组与模型组ChAT无统计学差异(P>0.05)。药物组、药线灸组分别与模型组、药线非穴组比较，ACh含量显著升高，AChE显著降低(P<0.05)；药物组与药线灸组比较无统计学差异(P>0.05)。药线灸组分别与模型组、药线非穴组比较ChAT含量均有显著升高(P<0.05)，并具有穴位特异性，但与正常组比较无差异(P>0.05)，已接近正常组水平；药物组与药线灸组比较无统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠海马ACh、AChE与ChAT含量比较

与模型组比较:1)P<0.05，2)P<0.01；与药线非穴组比较：3)P<0.05，4)P<0.01；与正常组比较:5)P<0.05

3 讨 论

胆碱能传导通路受损可引起胆碱能缺陷和学习记忆功能障碍〔9，10〕。而ACh是胆碱能传导通路的重要神经递质，脑内Ach存在于胆碱能神经元囊泡中；由ChAT合成，AChE分解，通过ACh受体发挥生物效应，在记忆、思维和智力中起着不可替代的作用。VD的胆碱能系统受损机制可能是由于缺血缺氧影响葡萄糖氧化代谢，使丙酮酸生成减少，从而使乙酰辅酶A生成减少，而后者为ACh的合成原料，最终导致ACh合成不足〔11〕，因而ACh是进行及维持高级神经功能的一种重要神经递质，ACh浓度升高有利于学习记忆的恢复，有利于改善痴呆症状〔12〕，是直接反映学习记忆能力的指标。AChE是ACh的水解酶，为观察胆碱能神经元的一个重要指标；ChAT是细胞内催化ACh合成的关键酶，在胆碱能神经元胞体内合成，与ACh分布几乎平行，常作为研究胆碱能神经元的标志或评估ACh含量的间接指标〔13〕；此二者相辅相成共同维持脑内ACh含量的动态平衡。脑缺血时AChE释放过多，分解ACh增强，导致ACh浓度降低，促进痴呆的发生〔14〕，因此通过抑制AChE活性，有利于改善VD症状。研究发现，VD 患者海马区和颞叶AChE有不同程度活性升高〔15〕。免疫组化染色发现，VD大鼠模型海马各区ChAT阳性神经元和纤维数量明显减少，且与大鼠的学习记忆障碍程度呈正相关〔16〕。MID模型是国内外认可的VD动物模型之一，具备VD最核心的认知行为学障碍，是进行VD基础研究和疗效评价的理想模型〔17,18〕。本实验证明：MID模型组大鼠海马ACh含量及ChAT活性较正常组大鼠明显降低，AChE活性显著性升高，是模拟VD的认知功能障碍和中枢胆碱能系统受损机制的理想模型，是本实验研究可行的保证。

“益气调血、扶本培元”该治则是基于“VD是与老年相关的、涉及三焦多个脏腑多脏器相关并夹杂诸多病理产物的疾病”、“三焦气化失常与衰老相关论”〔19〕提出的，并随笔者三焦与脑神经病变的理论及“三焦与痴呆的发病观、病机观及取穴优选”而相对完善〔20〕。“益气调血、扶本培元”药线灸又基于“益气调血、扶本培元”针法的成熟，该针法经历几十年临床及临床研究肯定疗效，动物实验肯定了取穴优选、改善VD认知功能和改善VD发病的中枢ACh代谢障碍机制。而在此基础上，数年来笔者发展为壮医药线灸方法的有效方法，在VD治疗上，临床已取得改善VD患者认知功能的证据〔21,22〕，实验提示该疗法的有效性。壮医药线灸疗法操作较麦粒灸等着肤灸简便，而不失着肤灸之功，保持了历代灸法尤其直接灸养生保健、抗老防衰的功用，是临床卓越的抗衰防老和防治VD的方法；此药线灸法防治VD具有从“三焦气化”论治VD的发病观、病机观、防治观与“益气调血，扶本培元”治则、组穴优选、临床疗效和实验机理的基础；本药线灸法显示的多途径、多靶点和多层次作用于VD的中枢ACh代谢障碍机制，是本实验取得更佳疗效的关键。

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〔2016-08-25修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

R749

A

1005-9202(2017)18-4467-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.015

广西壮族自治区卫生厅中医药科技专项任务书(No.GZZY13-06)；广西中医药大学重大课题(No.ZD12005)

1 2013级针灸硕士研究生 2 2014级针灸硕士研究生

罗本华(1968-)，男，医学博士，主任医师，硕士生导师，主要从事中医及壮医针灸防治神经系统疾病基础与临床研究。