重组Microdochium nivale还原糖氧化酶用于制备乳糖酸方法的研究

顾利敏， 周 星， 金征宇*， 徐学明， 周家慧

（1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122；2.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122）

重组Microdochium nivale还原糖氧化酶用于制备乳糖酸方法的研究

顾利敏1，2， 周 星1，2， 金征宇*1，2， 徐学明1，2， 周家慧1，2

（1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122；2.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122）

Microdochium nivale（M.nivale）还原糖氧化酶可以催化乳糖转化为乳糖酸，作者采用实验室保存的重组M.nivale还原糖氧化酶基因工程菌X33-pPICZαA-MnCO，通过诱导在毕赤酵母中表达并制备了重组M.nivale还原糖氧化酶，通过单因素和正交实验考查了乳糖浓度，重组M. nivale还原糖氧化酶用量，反应温度，反应时间对乳糖酸转化率的影响。结果表明：重组M. nivale还原糖氧化酶催化乳糖制备乳糖酸的最适转化条件为：乳糖浓度5 mmol/L，酶的添加量为1.5 U/ml，反应温度为55℃，反应时间为48 h，最终反应乳糖酸的转化率接近100%。

乳糖酸；乳糖；重组Microdochium nivale还原糖氧化酶；转化率

乳糖酸（Lactobionic acid，LA）是一种新型多羟基有机酸[1]，是集修护、抗衰老、保湿、抗氧化、促进机体更新[2]等多种功效于一身的最先进的果酸。在食品中乳糖酸可以做为食品添加剂，并且能够与矿物质盐形成复合物，促进肠道中益生菌的生长以及对矿物质的吸收[3]。在酸奶的制作过程中，乳糖酸的存在能够改善酸奶凝乳的持水力、调和酸味、促进风味形成。在肉制品中添加一定量的乳糖酸，可以减少肉制品在冷冻后产生的水分损失[3]。乳糖酸在医学中是是器官移植前保护性缓冲液的重要组分[5-6]，可螯合Fe3+，降低由于离子催化产生的氢氧自由基对组织的损伤，增加了器官的保存性[7]。在美容行业中，由于乳糖酸有极强的吸水性，并且能够促进上皮形成，加速伤口愈合，有修护肌肤的功效，因此乳糖酸可用于防止皮肤干燥以及肌肤修护[8]。

目前制备乳糖酸的方法有生物制备法[9]、化学氧化法[10]、电化学法和催化氧化法等多种方法，但是这些方法存在着副产物多，产物的分离纯化比较复杂以及化学污染等问题。生物酶法常以高效、绿色著称，目前酶法制备乳糖酸所使用的酶包括乳糖脱氢酶，葡萄糖果糖氧化酶和还原糖氧化酶，但是乳糖脱氢酶是一种膜蛋白，分离纯化过程复杂，且酶极易失活。葡萄糖果糖氧化酶可将乳糖和果糖转化为山梨醇和乳糖酸，但是山梨醇和乳糖酸混在一起使得乳糖酸的分离纯化极为复杂。Elizabeth J团队在Microdochium nivale（M.nivale）中发现一种还原糖氧化酶[11]，该酶可以将末端带有还原性糖残基的单糖和低聚糖氧化成相应的酸，没有其他副产物产生，具有更加有效催化乳糖氧化形成乳糖酸的潜力[12-13]。作者采用实验室保存的在C-末端加入组氨酸标签的重组M.nivale还原糖氧化酶基因工程菌，通过诱导在毕赤酵母中表达制备了重组M.nivale还原糖氧化酶，并研究了其作用于乳糖的最适温度和pH及优化了制备乳糖酸的反应条件。

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌种毕赤酵母X33-pPICZαA-MnCO：作者所在实验室保存；过氧化氢试剂盒、蛋白Marker：生工生物技术（上海）有限公司产品；乳糖、乳糖酸标品：Sigma公司产品；酵母粉、胰蛋白胨：英国Oxoid公司产品；其它分析纯试剂均购于国药集团化学试剂有限公司；YPD、BMGY种子培养基、BMMY诱导培养基：按Invitrogen公司毕赤酵母操作表达手册配制。

1.2 实验仪器

高速冷冻离心机 （BIOFUGE PRIMOR）：美国Thermo Scientific有限公司产品；低速台式大容量离心机（RJTDL-50A）：无锡瑞江分析仪器有限公司产品；双光束紫外可见分光光度计（TU-1900）：北京普析通用仪器有限责任公司产品；高效液相色谱仪（LC-20AT230V）、示差折光检测器 （RID-10A）、AKTA purifier 900蛋白纯化系统：岛津公司产品；NH2P-50色谱柱：美国Thermo公司产品；Ni-NTA亲和层析柱：GE Healthcare life sciences公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 重组毕赤酵母pPICZαA-MnCO的诱导表达将保存的菌种X33-pPICZαA-MnCO接种到YPD中，30℃，220 r/min培养至A600nm为2～3，按照体积分数3%的接种量接种到BMGY中，30℃，220 r/ min培养至A600nm为4～5，用无菌管离心收集菌体，菌体用BMMY悬浮，加入到含有BMMY的锥形摇瓶中，28℃，220 r/min每隔12 h添加甲醇至终体积分数0.5%，诱导表达72 h，离心收集上清液。将上清液放入pH 6.0的20 mmol/L的PBS中透析48 h，去除培养基中的大分子得到粗酶液。

1.3.2 重组 M.nivale还原糖氧化酶的分离纯化重组M.nivale还原糖氧化酶在C-末端加入组氨酸标签，镍柱中镍离子与组氨酸产生配位相互作用，选用镍柱亲合层析对其进行纯化。具体步骤为：用过膜（0.22 μm）并脱气后的超纯水冲洗 AKTA蛋白纯化系统，基线平稳后换淋洗液（50 mmol/L，pH 7.0的Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑）平衡Ni-NTA柱，流量为 1 mL/min，平衡完毕后将粗酶液通过0.22 μm的膜后进样，进样量为1 mL。待杂蛋白去除后换洗脱液（50 mmol/L，pH 7.0的Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑）洗脱目标蛋白，收集洗脱液[14]，将洗脱下来含M.nivale还原糖氧化酶的组分用20 mmol/L的PBS（pH 6.0）透析脱盐。采用SDS-PAGE对重组M.nivale还原糖氧化酶进行鉴定。

1.3.3 M.nivale还原糖氧化酶理化性质分析

1）SDS-PAGE电泳 浓缩胶质量浓度选为5 g/ dL，分离胶质量浓度选为12 g/dL，纯化酶液与5×样品缓冲液混合，沸水浴5 min，将10 μL处理好的样品加入到凝胶孔中，调节电压保持100 V。电泳结束，取出凝胶染色，选用质量分数为0.1%考马斯亮蓝R-250染色5 min后，换成考马斯亮蓝脱色液，震荡脱色[15]。

2）重组M.nivale还原糖氧化酶酶活的测定取200 μL的乳糖（0.1 mol/L）保温10 min，加入20 μL的酶液，在一定温度下避光反应20 min，采用过氧化氢试剂盒测定过氧化氢浓度。

酶活定义：在pH 6.0，50℃下1 min内催化乳糖反应产生1 μmol/L的过氧化氢所需的酶量为1 U。

3）蛋白质浓度的测定 标准品选用牛血清蛋白，采用Bradford法[16]对蛋白质浓度进行测定。

1.3.4 乳糖酸含量的测定 用高效液相色谱法对乳糖酸的含量进行定量测定，采用示差检测器检测，色谱柱为NH2P-50。流动相为乙腈和40 mmol/L Na2HPO4－20 mmol/L柠檬酸缓冲液，在pH 5.0的条件下，以0.8 mL/min的流量在40℃下泵入[17]。

1.3.5 重组M.nivale还原糖氧化酶作用于乳糖的最适温度和最适pH 在30～80℃范围内，以5℃为温度间隔，测定重组M.nivale还原糖氧化酶作用于乳糖的最适温度，测定的酶活最大值为100%，各温度条件下的酶活为相对酶活。

以不同pH的缓冲溶液为底物溶液，将pH分成3段 （3-6、6-8、8-9），依次选用20 mmol/L的柠檬酸/柠檬酸钠、磷酸氢二钠/磷酸二氢钠、氨酸/氢氧化钠缓冲液，在相同温度下测定重组M.nivale还原糖氧化酶作用于乳糖的活性，测定的酶活最大值为100%，各pH条件下的酶活为相对酶活。

1.3.6 单因素试验设计

1）乳糖浓度对乳糖酸转化率的影响 分别以1，5，10，25 mmol/L的乳糖为底物，每100 mL的反应液中添加3.0 U/mL的过氧化氢酶，通气量为0.6L/min，每隔12 h加入1.5 U/mL的重组M.nivale还原糖氧化酶，通过加入0.1 mol/L的Na2CO3溶液调节反应液的pH在5～6，55℃反应48 h后对乳糖酸的转化率进行分析。

2）加酶量对乳糖酸转化率的影响 以5 mmol/ L的乳糖为底物，每100 mL的反应液中添加3.0 U/ mL的过氧化氢酶，通气量为0.6 L/min，每隔12 h分别加入0.5，1.0，1.5，2.0 U/mL的重组M.nivale还原糖氧化酶，通过加入0.1 mol/L的Na2CO3溶液调节反应液的pH在5～6，55℃反应48 h后对乳糖酸的转化率进行分析。

3）反应温度对乳糖酸转化率的影响 以5 mmol/L的乳糖为底物，每100 mL的反应液中添加3 U/mL的过氧化氢酶，通气量为0.6 L/min，每隔12 h加入1.5 U/mL的重组M.nivale还原糖氧化酶，通过加入0.1 mol/L的Na2CO3溶液调节反应液的pH在5～6，分别在40，45，50，55，60℃反应48 h后对乳糖酸的转化率进行分析。

4）反应时间对乳糖酸转化率的影响 以5 mmol/L的乳糖为底物，每100 mL的反应液中添加3.0 U/mL的过氧化氢酶，通气量为0.6 L/min，每隔12 h加入1.5 U/mL的重组M.nivale还原糖氧化酶在55℃下反应，通过加入0.1 mol/L的Na2CO3溶液调节反应液的pH在5～6，分别在反应12，24，36，48，60 h后取样，对乳糖酸的转化率进行分析。

1.3.7 正交试验 在单因素实验的基础上，采用L9（34）正交表对乳糖浓度、加酶量、反应温度、反应时间进行优化，以乳糖酸转化率为评定指标，试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素与水平设计表Table 1 Design table of factor and level in orthogonal test

2 结果与讨论

2.1 重组M.nivale还原糖氧化酶的SDS-PAGE分析

以甲醇诱导表达的重组毕赤酵母X33/ pPICZαA-MnCO，诱导表达72 h，离心取上清，透析得到粗酶液，粗酶液经Ni-NTA纯化后得到重组M. nivale还原糖氧化酶，由图1可以看出粗酶液在60KDa出有明显条带，经Ni-NTA纯化后得到纯度大于95%的重组M.nivale还原糖氧化酶。

2.2 重组M.nivale还原糖氧化酶的酶活和蛋白质质量分数

经实验测定重组M.nivale还原糖氧化酶活力为500.435 U/mL，蛋白质质量分数为0.501 mg/mL。

图1 重组M.nivale还原糖氧化酶SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE anlysis of the recombinant MnCO

2.3 重组M.nivale还原糖氧化酶作用于乳糖的最适温度和最适pH

按照2.3.2中的方法测定重组M.nivale还原糖氧化酶作用于乳糖的最适温度和最适pH。图2显示，该酶作用于乳糖的的最适温度为55℃，最适pH为6.0，且pH值在4.0～6.0时，酶活大于85%，该特性有助于重组M.nivale还原糖氧化酶催化乳糖氧化转化为乳糖酸。

图2 重组M.nivale还原糖氧化酶作用于乳糖的最适温度与pHFig.2 Optimal reaction pH of the recombinant MnCO on lactose

2.4 单因素试验

2.4.1 乳糖浓度对乳糖酸转化率的影响 由图3可以看出，乳糖浓度为10 mmol/L和25 mmol/L时，转化率均低于60%。当乳糖浓度为1 mmol/L和5 mmol/L时，转化率接近100%，造成这一现象的原因可能为：随着乳糖浓度的增大。乳糖与酶分子之间无法充分相互接触，从而使得乳糖酸的转化率降低。

图3 乳糖浓度对乳糖酸转化率的影响Fig.3 Effect of concentration of lactose on the LA conversion rate

2.4.2 加酶量对乳糖酸转化率的影响 由图4可以看出加酶量为0.5 U/mL时，乳糖的转化率大于90%，提高加酶量至1.0 U/mL时乳糖的转化率接近100%。造成这一现象的原因可能为：酶的浓度较低时，酶分子不能够完全与乳糖相互接触，从而使得乳糖酸的转化率较低，增加酶浓度之后，酶分子与乳糖完全接触，能够完全催化乳糖转化为乳糖酸。

图4 加酶量对乳糖酸转化率的影响Fig.4 Effect of the amount of MnCO on the LA conversion rate

2.4.3 温度对乳糖酸转化率的影响 由图5可以看出在40℃到55℃，随着温度的上升乳糖的转化率也呈现上升趋势，在55℃时达到最高，接近100%，当反应温度为60℃时乳糖的转化率下降，出现这种现象的原因可能是当温度较低时，重组M. nivale还原糖氧化酶的活性中心没有完全打开，当温度升高后，活性中心完全打开，能够完全氧化乳糖成乳糖酸，当反应温度高于重组M.nivale还原糖氧化酶做用于乳糖的最适温度后，部分酶分子在反应过程中已经失去活性，使得乳糖酸的转化率降低[18]。

2.4.4 反应时间对乳糖酸转化率的影响 由图6可以看出，在12～48 h内随着反应时间的延长，乳糖酸的转化率逐渐上升，在反应至36 h乳糖酸的转化率达到96%，在反应48 h后达到最高，为99.98%，接近100%。

图5 温度对乳糖酸转化率的影响Fig.5 Effect of temperature on the LA conversion rate

2.5 正交试验结果

通过正交试验可知，影响乳糖酸转化率的因素大小依次为A（乳糖浓度）＞B（反应时间）＞D（反应温度）＞C（加酶量），最佳工艺为A2B2C2D2，即乳糖浓度为5 mmol/L，反应时间为48 h，反应温度为55℃，加酶量为1.5 U/mL。按照此方案进行验证试验，乳糖酸的转化率为99.98%。

图6 时间对乳糖酸转化率的影响Fig.6 Effect of temperature on the LA conversion rate

3 结语

通过研究重组M.nivale还原糖氧化酶作用于乳糖的最适温度和最适pH及重组M.nivale还原糖氧化酶作用于乳糖制备乳糖酸的条件，测定重组M.nivale还原糖氧化酶活力为500.435 U/mL，蛋白质质量浓度为0.501 mg/mL，其作用于乳糖的最适温度为55℃，最适pH为6.0，当乳糖浓度为5 mmol/L，在55℃下加入1.5 U/mL的重组M.nivale还原糖氧化酶反应48 h后可将乳糖转化为乳糖酸，转化率接近100%。

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会议名称(中文)：2017中国生物材料大会

所属学科：生物技术与生物工程,生物及医药化工,纺织材料与纺织技术,材料科学基础学科

开始日期：2017-10-27

结束日期：2017-10-29

所在城市：江西省 南昌市

主办单位：中国生物材料学会、中国生物医学工程学会生物材料分会、华东交通大学

会议主席：王迎军 万明

联系人：敖海勇15797863906

联系电话：0791-87046893

E-MAIL：aohyong@126.com

会议网站：http://clxy.ecjtu.edu.cn/meeting2017/Action/TouristMain

会议背景介绍：由中国生物材料学会（CSBM）、中国生物医学工程学会生物材料分会（CSBME-BMB）和华东交通大学共同主办的“2017中国生物材料大会”将于2017年10月27-29日在“英雄城”南昌举行。 “2017中国生物材料大会”以“生物医用材料创新研发与产业化”为主题，邀请学养深厚的专家学者就生物材料科学与产业的研究热点、发展前沿在南昌论道。大会将由6个大会报告、24个专题报告会（专题分会场近百个）、4个专题研讨会及论坛和墙报等组成。

Utilization of Recombinant Carbohydrate Oxidase from Microdochium nivale for Lactobionic Acid Production

GU Limin1，2， ZHOU Xing1，2， JIN Zhengyu*1，2， XU Xueming1，2， ZHOU Jiahui1，2
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The carbohydrate oxidase from Microdochium nivale（MnCO）can catalyze the oxidation of lactose to produce lactobionic acid.In this study，we used the recombinant MnCO which expressed in Pichia pastoris from the genetically engineered bacteria X33-pPICZαA-MnCO stored in our lab.The production of lactobionic acid was optimized by single factor experiment and orthogonal test.The optimal fermentation conditions for the production of lactobionic acid were as follows：the concentration of lactose solution of 5 mmol/L，the amount of enzyme of 1.5 U/ml，the reaction temperature of 55℃，the reaction time of 48 h，the conversion rate of lactose to lactobionic acid could reach to 100%.

lactobionic acid，lactose，recombinant MnCO，conversion rate

TS 236.9

：A

：1673—1689（2017）07—0720—06

2015-06-23

江苏省自然科学基金项目（BK20130140）；江苏省科技支撑计划项目（BE2013311）。

*通信作者：金征宇（1960—），男，江苏扬州人，教授，博士研究生导师，主要从事碳水化合物化研究。E-mail：zjin@jiangnan.edu.cn

顾利敏，周星，金征宇，等.重组Microdochium nivale还原糖氧化酶用于制备乳糖酸方法的研究 [J].食品与生物技术学报，2017，36（07）：720-725.