肉类掺假的分子生物学检测

石盼盼，李 旭， 魏法山， 谢文佳

（河南省产品质量监督检验院，河南 郑州 450002）

肉类掺假的分子生物学检测

石盼盼，李 旭， 魏法山， 谢文佳

（河南省产品质量监督检验院，河南 郑州 450002）

针对GeneBank中公布的牛羊猪鸡鸭线粒体细胞色素氧化酶亚基基因的特异性序列设计引物，建立了肉样的5种常见牛羊猪鸡鸭动物源性成分检测的PCR电泳法体系。采用大连宝生物的猪源牛源羊源鸡源性成分检测试剂盒和广州迪奥生物的鸭源性成分检测试剂盒，利用实时荧光PCR检测体系对河南省范围内几个大型超市的118批次牛肉样品的5种即猪牛羊鸡鸭动物源性成分进行了检测。结果显示：牛源性成分检出117批次检出率99.15%，猪源性成分检出10批次检出率8.47%，鸡源性成分检出7批次检出率5.93%，鸭源性成分检出1批次检出率0.85%，没有检出羊源性成分，其中熟肉制品掺杂其他源性成分的比例较高。与配料表对比掺假使假样品共9批次，总掺假率为7.63%。

肉类掺假；PCR；实时荧光PCR；检测

肉类掺假是食品安全面临的难题。鉴别肉及肉其制品是否掺假已成为食品安全检测和监管机构迫切需要解决的问题，利用基因检测技术鉴别动物源性成分可迅速准确地鉴定产品中是否含有其他肉类成分[1-9]。作者依托河南省质检院食品中心分子生物学实验室平台，在长期从事肉制品动物源性成分检验的基础上，针对标准检验方法[10]中实时荧光PCR技术灵敏度高易出现假阳性的缺陷，设计引物摸索实验条件，最终建立了肉及肉制品中动物源性成分检测的普通PCR电泳法检测体系，在实际检测中可以作为标准检验方法的补充，进一步保障检验结果的准确性[11]。

作者检测了河南省范围内大型超市118批次牛肉样品的猪牛羊鸡鸭动物源性成分，并细分产品种类了解不同牛肉产品动物源性成分检出情况，通过与配料表对比了解产品的掺假情况，验证了试剂盒的有效性，为相关检验工作提供技术支持。进一步统计的生鲜牛肉，酱牛肉，熟牛肉干制品，速冻调理牛肉制品4种不同种类产品的动物源性成分检出情况，使消费者对不同种类牛肉产品的成分及掺假情况有了更深一步的了解。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试剂盒特异性和灵敏度检测实验用到的生鲜牛肉，羊肉，猪肉，鸡肉，鸭肉为作者所在实验室保存，其他生鲜牛肉及酱牛肉，熟牛肉干制品，速冻调制牛羊肉制品均购自河南省沃尔玛，家乐福，丹尼斯等各大型超市。溴化乙锭，牛源，猪源，羊源，鸡源性成分实时荧光PCR检测试剂盒：宝生物（大连）生物工程有限公司产品；鸭源性成分实时荧光PCR检测试剂盒：自广州迪奥生物公司产品；牛羊猪鸡鸭源性成分普通PCR引物：宝生物合成。

1.2 主要仪器设备

Milli-Q超纯水系统：美国密理博公司产品；HFsafe生物安全柜：上海力申科学仪器有限公司产品；LightCycle480荧光PCR仪：罗氏诊断产品有限公司产品；Colibri Titertek Berthold超微量分光光度计：上海科瑞生物科技有限公司产品；水平电泳仪及制胶板、凝胶成像系统：美国BIO-RAD公司产品；移液器、普通PCR仪，小型离心机：美国Eppendorf公司产品。

1.3 PCR反应条件

普通PCR扩增程序为：94℃，10 min；（94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min）x40；72℃，5 min，4℃保存。

荧光定量PCR扩增程序为：95℃，10 sec；（95℃，5 s；60℃，30 s；）x45；50℃，2 min。

1.4 测定方法

1.4.1 DNA提取 酚氯仿抽提法：多点取样（对于加工肉制品需用水浸泡去盐后再取样），用解剖剪剪碎后，取适量样品放入研钵中液氮冷冻研磨至粉末状，称取50 mg研磨物至1.5 mL离心管中，加入700 μL DNA提取裂解液，置65℃水浴3 h，期间不时震荡混匀；12 000 r/min离心5 min，转移上清至新的1.5 mL离心管中，加入等体积苯酚氯仿与异戊醇（25∶24∶1）的混合溶液，充分混匀后，12 000 r/min离心5 min；取上清，加入1/10体积的3 mol/L醋酸钠溶液，混匀后加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃静置1～3 h，12 000 r/min离心5 min弃去上清；加体积分数70%乙醇溶液洗涤1～2次，超净台内室温下晾干后，加50 μL TE缓冲液，最终获得A260nm/A280nm在1.8～2.0之间的DNA溶液。

1.4.2 PCR扩增

1）引物 检测所用引物具体序列见表1。

表1 猪牛羊鸡鸭源性成分普通PCR检测引物列表Table 1 Primers of bovine，ovine，procine，chicken，duck five Animal-derived materials by PCR

2）普通PCR扩增 分别提取牛肉，羊肉，猪肉，鸡肉，鸭肉样品的DNA，用牛源性引物扩增牛肉样品DNA，羊猪鸡鸭源性引物分别扩增羊猪鸡鸭肉样品DNA。25 μL扩增体系为：DDW 9.5 μL，2×PCR Master Mix 12.5 μL，primer For（10 μmol/L）1 μL，primer Rev（10 μmol/L）1 μL，模板DNA（50～100 ng/ μL）1 μL。PCR扩增程序为：94℃，10 min；（94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min）x40；72℃，5 min，4℃保存。PCR扩增产物用质量分数1.5%的琼脂糖凝胶，水平电泳仪150 V电泳40 min分离扩增产物，凝胶成像系统观察结果。

3）实时荧光PCR扩增 按1.3.1方法提取牛肉DNA，依照试剂盒说明书进行实时荧光PCR扩增。25 μL PCR扩增体系：DDW 9.5 μL，2×Premix 12.5 μL，Primer Mix 1 μL，Probe Mix 1 μL，样品DNA（50 ng/μL左右）1 μL。扩增程序为：95℃，10 s；（95℃，5 s；60℃，30 s；）x45；50℃，2 min。扩增结束后用LightCycle480软件分析CT值和扩增曲线，结合标准和试剂盒说明书判断扩增结果。

2 结果与讨论

2.1 PCR电泳法检测牛羊猪鸡鸭肉动物源性成分结果

依1.3.1方法提取各样品的DNA，提取的牛肉，羊肉，鸡肉，猪肉，鸭肉样品的DNA总质量浓度分别为：100、113、107、105、108 ng/μL；调整使PCR模板浓度达到50～100 ng/μL，依照1.3.2.2分别用对应引物进行PCR扩增。结果显示，用牛源性引物可以扩增出牛肉样品约79 bp的条带，羊源性引物可以扩增出羊肉样品约98 bp的条带，与目的条带大小一致（如图1所示）。同样如图2所示，用猪源性引物可以扩增出猪肉样品约71 bp的条带，鸡源性引物可以扩增出鸡肉样品约89 bp的条带，鸭源性引物可以扩增出鸭肉样品约85 bp的条带，与目的条带大小一致。电泳条带清晰单一，此结果说明构建的PCR方法体系可用于鉴定猪牛羊鸡鸭肉各自的动物源性成分。

2.2 牛源性成分实时荧光PCR检测试剂盒特异性和灵敏度检测结果

2.2.1 牛源性成分检测试剂盒特异性检测结果提取的牛肉，羊肉，鸡肉，猪肉，鸭肉样品的DNA总质量浓度分别为：140、113、107、105、108 ng/μL；用TE缓冲液稀释至相同且合适的质量浓度，分别以5种DNA为模板，按照牛源性检测试剂盒说明书进行实时荧光PCR扩增，结果如图3所示，只有以牛肉DNA为模板时才能发生特异性扩增，而其他样品DNA没有扩增。这说明牛源性检测试剂盒用来检测牛肉DNA特异性良好，没有交叉反应。

图1 牛羊源性DNA PCR扩增结果Fig.1 PCR result of bovine and ovine-derived materials

图2 猪鸡鸭源性DNA PCR扩增结果Fig.2 PCR result of procine，chicken，duck-derived materials

图3 牛源性检测试剂盒特异性试验结果Fig.3 Specificity result of real time PCR Bovine DNA detection kit

2.2.2 牛源性成分检测试剂盒灵敏度检测结果提取牛肉样品DNA，用TE稀释，使牛肉DNA分别呈100，10，1，0.1，0.01 ng/μL浓度梯度，用牛源性试剂盒检测牛肉样品各梯度DNA，实时荧光PCR结果如图4，从左至右依次是100，10，1，0.1，0.01 ng/ μL牛肉样品 DNA的扩增曲线，CT值依次为16.37，19.33，22.25，29.32，36.49。根据试剂盒的判定原则，当DNA质量浓度为0.01 ng/μL时CT值大于35，为阴性结果，所以此结果表明牛源性试剂盒可以检测低至0.1 ng/μL质量浓度的目标DNA。用同样方法检测羊猪鸡鸭源性试剂盒，结果显示检测最低质量浓度也可达到0.1 ng/μL。

图4 牛源性检测试剂盒灵敏度试验结果Fig.4 Sensitivity result of real time PCR Bovine DNA detection kit

2.3 牛肉样品5种牛羊猪鸡鸭动物源性成分检验结果

检测了河南省大型超市的118批次牛肉样品的猪牛羊鸡鸭5种动物源性成分。牛源性成分检出117份，检出率为99.15%；猪源性成分检出10份，检出率为8.47%；鸡源性成分检出7份，检出率为5.93%；鸭源性成分检出1份，检出率为0.85%；羊源性成分检出0批次。

118 批次样品分为4类，分别统计各类产品的动物源性成分检出情况，并与样品配料表对比，了解掺假情况，统计结果如表2所示：生鲜牛肉18批次，全部仅检出牛源性成分检出率为100%。酱牛肉50批次，47批次仅检出牛源性成分，2批次同时检出牛源和鸡源成分另有1批次样品仅检出猪源性成分，牛源鸡源猪源的检出率分别为98%，6%和2%；同时检出牛源鸡源的2批次样品因无法排除配料中添加的鸡精对检出鸡源性的影响，判定为合格品，仅检出猪源成分的1批次样品配料标注为牛肉，判定为不合格品。熟肉干制品共38批次，27批次仅检出牛源性成分，3批次同时检出牛源鸡源性成分，8批次同时检出牛源猪源性成分，牛源鸡源猪源的检出率分别为100%，7.89和21.05%；检出牛源猪源的8批次样品配料中没有猪肉成分，判断为掺假品。速冻调制肉制品12批次，9批次仅检出牛源性成分，其中1批次牛肉丸同时检出牛源猪源鸡源鸭源；另2批次为复合牛肉片同时检出牛源和猪源，牛源鸡源猪源的检出率分别为100%，7.89和21.05%；样品检出情况与配料标注一致，故全部为合格品。

表2 4类牛肉样品检测情况汇总表Table 2 Testing summary table of four kinds of samples

3 结语

鉴于实时荧光PCR其灵敏度极高，在实际检验中有时无法排除因包装运输及检测过程中污染出现的假阳性结果[12]，作者建立了常见肉类动物源性成分检测的普通PCR电泳法，可以实现对牛羊猪鸡鸭肉样品的种属鉴定，在实际检验中可作为实时荧光PCR法的补充，使得样品的检验更严谨。同时验证了TAKARA牛源性成分实时荧光PCR检测试剂盒检测样品的特异性和灵敏度，方法有效，结果良好。

总而言之，大型超市的牛肉产品掺杂猪肉鸡肉情况比较严重，主要是加工牛肉制品，其中熟肉干制品是牛肉掺假的重灾区。监管部门可做专项监管整治，对于消费者，在选购时最好挑选正规场所大品牌的牛肉产品，并且看清配料表。

本次118批次牛肉样品中每种牛肉产品批次不等，样本量太小如速冻调制共12批次，导致结论可能不具有普遍意义。另外采用实时荧光PCR检测方法灵敏度高，当产品为了增加口感添加极少量其他动物源性成分如非清真食品的酱牛肉，卤汁中可能含有少量鸡源或猪源成分，牛肉干表面添加鸡精鸡粉，这些会导致牛肉样品中检出猪源鸡源成分，难以判断是否是掺假样品，食品标签管理需要进一步完善。如果可以找到合适的物种基因组中特异性单拷贝基因，以之为靶基因，通过荧光定量PCR技术实现对样品各种动物源性成分的基因水平定量检测，对肉品的掺假情况把控会更加的精准[13-15]。

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Molecular Biological Detection for Adulterated Meat

SHI Panpan， LI Xu， WEI Fashan， XIE Wenjia
（Institute of Products Quality Supervision and Inspection in Henan Province，Zhengzhou 450002，China）

This article estiblished PCR examination system for five bovine，ovine，procine，chicken，duck-derived materials of meat.Five animal-derived materials of 118 batches beef samples at several big supermarkets in Henan Province were detected by using TAKARA and Deaou real-time PCR detection kit，And result showed that 117 batch samples had bovine-derived material for 99.15%，10 batch samples had procine-derived material for 8.47%，7batch samples had chicken-derived material for 5.93% ，just 1batch sample had duck-derived material for 99.15%and no sample had ovine-derived material，The adulteration ratio of done meat products is higher.There are 9 batches of adulteration with the ratio of 7.63%.

meat adulteration，PCR，real-time PCR，detection

TS 251

：A

：1673—1689（2017）07—0773—05

2015-08-14

石盼盼（1987—），女，河南洛阳人，助理工程师，主要从事食品检验研究。E-mail：523150920@qq.com

石盼盼，李旭，魏法山，等.肉类掺假的分子生物学检测[J].食品与生物技术学报，2017，36（07）：773-777.