葡聚糖-两性霉素B的制备及其抑菌活性研究

邱立朋， 曹 莹， 朱梦琴， 赵 丽，陈敬华

（江南大学 药学院，江苏 无锡 214122）

葡聚糖-两性霉素B的制备及其抑菌活性研究

邱立朋， 曹 莹， 朱梦琴， 赵 丽，陈敬华*

（江南大学 药学院，江苏 无锡 214122）

通过高碘酸钠氧化，合成了3种氧化度的葡聚糖衍生物（D-CHO），并利用D-CHO醛基和两性霉素B（AmB）氨基的席夫碱反应，制备了水溶性葡聚糖-AmB（D-CHO-AmB）共轭物。多角度激光光散射凝胶色谱仪结果表明，随着葡聚糖的相对分子质量随着氧化度的增大而降低。不同D-CHO-AmB的载药量在18.9%-36.7%之间，且氧化度越高，载药量越大。D-CHO-AmB的溶血作用比AmB注射剂显著性降低，且具有较好的抑菌效果。

两性霉素B；葡聚糖；溶血；抑菌作用

两性霉素B（Amphotericin B，AmB）是一种优良的大环多烯类抗生素，具有广谱抗真菌作用，对多种真菌、原生病原菌都有良好的抑制效果，而且不易对菌株产生耐药性[1-2]。但是AmB的水溶性差，导致它口服利用度较低，限制了其口服给药的应用[3]。因此，通常改变AmB的剂型来提高它在非肠道给药时的疗效。目前临床上使用的是用去氧胆酸钠作为增溶质制成的AmB注射剂[4-5]。近年来，AmB脂质体等新型制剂的上市，在一定程度上降低了AmB的副反应，提高了疗效，但该脂质体剂型在人体内的消除速率很慢，易在人体内积聚[6-7]。多糖具有毒性小、生物可降解等特点，作为药物载体材料已引起了研究者的重视[8]。其中，葡聚糖来源丰富，其作为载体材料在体内具有类似聚乙二醇的 “隐形”特点[9-11]。此外，葡聚糖可以在体内被葡聚糖酶降解，具有较好的生物可降解性，因此常作为药物载体材料使用[12-13]。作者选择具有良好生物相容性的葡聚糖，合成氧化葡聚糖（D-CHO）后，与AmB链接制备水溶性较好的葡聚糖-两性霉素B（D-CHO-AmB）共轭物，为后续安全有效的AmB注射剂的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

两性霉素B：购于上海生工生物工程股份有限公司；葡聚糖：（相对分子质量40 000）、高碘酸钠（NaIO4）、氢氧化钠（NaOH）、二甲亚砜（DMSO）和葡萄糖等：国药集团上海化学试剂有限公司；蛋白胨、酵母膏提取物：Sigma-Aldrich公司。

AVANCEⅢ型核磁共振仪：瑞士Bruker公司产品；UV-2550型紫外分光光度计：日本岛津仪器有限公司产品；FreeZone型冷冻干燥仪： 美国Labconco公司产品；5804R型冷冻高速离心机：德国Eppendorf公司产品；MALS/GPC型凝胶色谱系统：美国Wyatt公司产品。

试验菌株：白色念珠菌，作者所在实验室保存。

1.2 D-CHO的合成及结构确证

制备氧化度 （Oxidation Degree，OD）分别为50%，75%，100%的葡聚糖。称取一定量的葡聚糖溶于适量去离子水中，加入不同量的高碘酸钠溶解搅拌，室温避光反应4 h。得到的溶液去离子水透析3天除去杂质，冻干得D-CHO产物，1H-NMR谱确认其结构。如无特别说明，OD值指理论值，得到的产物分别标记为D-CHO50，D-CHO75，D-CHO100。

1.3 D-CHO相对分子质量的测定

通过多角度激光光散射凝胶色谱联用仪测量3种不同氧化度D-CHO的相对分子质量。首先精确配制质量浓度梯度为0.5，1，2，3，4，5 mg/mL的葡聚糖样品，依次进样测定（dn/dc）值。然后选择型号分别为Shodex OHpak SB-803和SB-804的两根色谱柱串联连接，0.2 mol/L氯化钠-质量分数0.01%叠氮钠溶液为流动相。配制样品质量浓度为5 mg/mL，0.22 μm滤膜过滤后，进样，采集数据，计算相对分子质量。

1.4 D-CHO氧化度的测定

称取0.1 g D-CHO溶解于25 mL盐酸羟胺溶液中，室温搅拌6 h。然后用0.1 mol/L氢氧化钠滴定。OD值按下列公式计算：

其中，Mw为D-CHO单元平均相对分子质量，VNaOH为消耗氢氧化钠的体积（mL），CNaOH为氢氧化钠的摩尔浓度（mol/L），m为样品的质量（g）。

1.5 D-CHO-AmB的合成及结构确证

根据文献报道[14]，称取不同氧化度的D-CHO和AmB溶解于25 mL四硼酸钠缓冲液中，室温条件下，避光搅拌3 h。反应液去离子水透析3 d，除去杂质，冻干得黄色产物，标记为D-CHO50-AmB、DCHO75-AmB、D-CHO100-AmB。

合成产物通过紫外可见吸收光谱的吸收峰情况进行表征。将药物共轭物、AmB、葡聚糖、D-CHO分别溶于甲醇-水溶液中，用紫外分光光度计进行全波长扫描。

1.6 载药量的测定

1.6.1 AmB标准曲线的测定 称取5 mg AmB于100 mL容量瓶中，甲醇溶液溶解并定容至刻度，得到50 μg/mL的母液。然后量取适量的AmB母液，稀释成质量浓度为2、4、6、8、10 μg/mL系列溶液，用紫外分光光度计在383 nm处测得吸光度，以吸光度值A对浓度C进行线性回归，得标准曲线。

1.6.2 精密度和回收率 按上述方法配制2、6、10μg/mL的AmB溶液，重复测定5次吸光度计算日内精密度，连续测定5天吸光度计算日间精密度。

取AmB适量，精密称定，置于10 mL容量瓶内，配成2、6、10 μg/mL的溶液，分别测定吸光度，按照标准曲线计算回收率。

1.6.3 载药量的测定 分别称取D-CHO50-AmB、D-CHO75-AmB和D-CHO100-AmB溶于甲醇溶液中，配成一定质量浓度的溶液后，于383 nm处测量吸光度。根据AmB标准曲线，计算样品中AmB的质量浓度。

1.7 D-CHO-AmB溶血性考察

取适量健康志愿者血液加入生理盐水洗涤并配成体积分数10%的红细胞混悬液 （Red blood cell，RBC）。分别取2.5 mL D-CHO-AmB样品溶液后，加入2.5 mL红细胞悬液，使AmB终质量浓度为50、100、250、500和1 000 μg/mL，37℃水浴2 h，3000 r/min离心5 min，收集上清液，用紫外分光光度计于545 nm处测量吸光度，计算样品溶血性。

按照市售AmB注射剂处方，配制对照组溶液。称取10 mg AmB和8.2 mg脱氧胆酸钠溶于40 mL生理盐水中，加入红细胞悬液，使AmB终质量浓度在5、10、25、50和100 μg/mL之间，其余操作同上。

1.8 D-CHO-AmB抑菌活性评价

1.8.1 最小抑菌浓度 （Minimal inhibitory concentration，MIC） 采用微量基稀释法检测抗真菌药物的敏感性[15]。配制质量浓度为1.2～640 μg/mL的DCHO-AmB溶液及0.06-32 μg/mL的AmB溶液，分别取100 μL加入96孔板每排的1～10孔内，第11孔加100 μL培养基作为生长对照，第12孔加200 μL培养基作为空白对照。然后，将白色念珠菌悬液100 μL加入每排的1-11孔中，置于35℃恒温箱中培养24 h后，通过视觉法判定MIC值终点，即与生长对照孔比较，菌体生长完全被抑制，培养基清亮孔所对应的药物浓度为MIC。

1.8.2 抑菌圈实验 采用管碟法测定D-CHO100-AmB的抑菌活性。将白色念珠菌混悬液与培养基混合后，加注到底层培养基上，转动平板，使其均匀铺开。将小钢管均匀放置在双层培养基上，并加入200 μL不同样品，35℃恒温培养24 h后观察结果。每个平板放3个小钢管，分别加入AmB终质量浓度为2 mg/mL的D-CHO50-AmB溶液和AmB悬浮液，同时加入无菌用水作为空白对照。

2 结果与讨论

2.1 D-CHO的合成

高碘酸钠与葡聚糖按不同摩尔比反应，得到不同氧化度的D-CHO，合成反应原理如图1。高碘酸根离子进攻葡聚糖单元相邻的两个羟基，使C3-C4或者C2-C3间的C-C键断裂，氧化成两个醛基。C3位的醛基与邻近的羟基可进一步发生氧化反应，C3从葡聚糖单元中断开，形成甲酸。据Joao等人[16]的报道，C3-C4键的断裂速率大约是C2-C3键的7.5倍，因此，C3-C4间的氧化最具代表性。通过DCHO的1H-NMR谱图（图2）可以看出，δ 3.46-3.67处葡聚糖环2，3，4位的H峰消失，而δ 9.22处出现了新的醛基特征峰，这表明D-CHO制备成功。

图1 葡聚糖氧化示意图Fig.1 Schematic of dextran oxidation

2.2 D-CHO相对分子质量的测定

相对分子质量是聚合物的一个重要性质，它与聚合物的溶解性、粘度和体内清除率等性质都密切相关。作者采用多角度激光光散射凝胶色谱仪测得葡聚糖的（dn/dc）值线性方程为y=0.136 4x+0.000 01（r=0.999 1），线性拟合良好。葡聚糖及其氧化产物的相对分子质量分布如图3所示，氧化后的葡聚糖出峰时间延长，即相对分子质量变小。由表1看出，与葡聚糖相比，氧化葡聚糖的相对分子质量明显变小，且氧化度越高，相对分子质量越小，表明该氧化反应导致葡聚糖的降解。

图2 葡聚糖和D-CHO的1H-NMR谱图Fig.21H-NMR spectra of dextran and D-CHO

表1 葡聚糖及其氧化产物的相对分子质量Table 1 Molecular weight of dextran and D-CHO

2.3 D-CHO氧化度的测定

盐酸羟胺法是测定葡聚糖氧化度的一个经典方法，该方法反应迅速，2 h内即有80%以上的醛基反应[17]。D-CHO氧化度的测定结果如表2所示。可以看出，盐酸羟胺测得的OD比理论OD低，这可能是被氧化葡聚糖形成的醛基与本身未反应的羟基易发生半缩醛反应，形成稳定的六元环，阻止醛基与盐酸羟胺反应，使测得的结果偏低。

图3 葡聚糖（a）、D-CHO50（b）、D-CHO75（c）和D-CHO100（d）的相对分子质量分布图Fig.3 Molecular weight distribution of dextran（a），D-CHO50（b），D-CHO75（c）and D-CHO100（d）

表2 D-CHO的氧化度Table 2 Oxidation degree of D-CHO

2.4 D-CHO-AmB的制备

葡聚糖经高碘酸钠氧化后，开环得到多聚醛葡聚糖，然后通过席夫碱反应，使AmB的氨基和DCHO的醛基连接形成腙键，制备D-CHO-AmB共轭物，并利用紫外可见吸收光谱进行全波长扫描对其进行鉴定，结果如图4所示。由图可以看出，葡聚糖及3种不同氧化度的D-CHO在200～500 nm范围内几乎没有吸收。AmB的特征吸收峰分别是363，382，406 nm，制备得到的3种D-CHO-AmB的特征吸收峰与AmB基本相同，分别是363，383，406 nm，表明成功合成了D-CHO-AmB共轭物。3种DCHO-AmB共轭物的扫描图谱基本相同，表明醛基数量不影响D-CHO-AmB的结构。然而，D-CHOAmB和AmB的吸收峰略有差异，且峰强度变为逆序，这可能是由于AmB和D-CHO发生反应后，其多烯的构象变化引起的。Neshi等人的研究也表明，多烯类的紫外吸收光谱很容易受构象的改变而发生改变[18]。

图4 葡聚糖、D-CHO和D-CHO-AmB的紫外可见光图谱Fig.4 UV-vis absorption spectra of dextran，D-CHO and D-CHO-AmB conjugates

2.5 载药量测定

2.5.1 AmB标准曲线的测定 由紫外可见吸收光谱可知，修饰后的AmB特征吸收峰基本不变，因此本实验选择383 nm作为最佳吸收波长。以AmB浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，进行线性回归，绘制标准曲线。线性回归方程为：A=0.023 1C+ 0.025 4（r=0.999 0），表明AmB在2～10 μg/mL范围内浓度和吸光度呈良好的线性相关性。

2.5.2 精密度和回收率 AmB低中高3个浓度的精密度和回收率试验。各个质量浓度的精密度RSD值均小于2%，平均回收率在98.0%-102.0%之间，表明本方法的日内精密度、日间精密度以及回收率符合方法学要求。

2.5.3 载药量的测定 通过紫外法测得DCHO50-AmB、D-CHO75-AmB和D-CHO100-AmB的载药量分别为18.9%、21.8%和36.7%，表明载药量随着葡聚糖氧化度的提高而变大。这是由于葡聚糖氧化度越高，可以与AmB反应位点越多，致使链接到D-CHO上的药物越多，载药量增大。

2.6 D-CHO-AmB溶血性 通过预实验发现，DCHO-AmB的溶血性较低，因此，选择了较高的质量浓度与AmB注射剂比较。AmB质量浓度在50～1 000 μg/mL范围内，D-CHO-AmB的溶血率变化缓慢，而AmB注射剂中AmB质量浓度较低时，溶血率较小，当质量浓度超过50 μg/mL时，溶血率迅速增加，具有较为严重的溶血作用。因此，AmB经葡聚糖修饰后，溶血性显著降低，安全系数也明显高于AmB注射剂。

2.7 D-CHO-AmB抑菌活性评价

2.7.1 MIC的测定 通过微量基稀释法，测定DCHO-AmB和AmB的最小抑菌浓度，观察AmB修饰前后的抑菌活性的变化。

葡聚糖修饰AmB后，导致相对分子质量增大，MIC值升高。此外，由于3种共轭物的载药量不同，其MIC值也有所不同。载药量最小的D-CHO50-AmB的MIC值最大，D-CHO100-AmB的抑菌效果要好于D-CHO75-AmB的。

2.7.2 抑菌圈实验 通过MIC测定结果可知，与AmB相比，修饰后的D-CHO-AmB的MIC值增大，即最低抑菌浓度升高。为了验证相同浓度AmB下，两者的抑菌效果，作者选择D-CHO100-AmB观察抑菌圈效果。D-CHO100-AmB的钢管外部出现了一个明显的抑菌圈，而AmB仅围绕钢管有一较小的抑菌圈，空白对照则无抑菌圈出现。这表明制备的D-CHO-AmB通过增加AmB的水溶性，达到更好的抑菌效果。因此，改变AmB的疏水性，不仅不会使其抗菌活性丧失，而且增加其水中抗菌活性。这是由于AmB与大分子葡聚糖结合后，虽然增加了AmB的水溶性，但其抗菌活性中心的疏水性多烯侧链结构并没有发生改变，因此发挥较好的抑菌活性。

3 结语

AmB通过静脉滴注治疗深部真菌感染的效果较好，但其水溶性差，现有注射剂的不良反应较多，并可造成血栓性静脉炎。因此，制备AmB新剂型或者提高药物本身溶解性一直是研究的热点。作者选择葡聚糖与AmB通过席夫碱反应制备D-CHOAmB共轭物。由于葡聚糖具有良好的生物适应性及水溶性，因此，D-CHO-AmB可以提高AmB的水溶性，同时不影响药物作用。氧化度高的D-CHOAmB载药量达到36.7%，表明该共轭物可以较好地携载AmB。D-CHO-AmB与AmB注射剂相比，溶血性显著性降低，溶血临界浓度提高了10倍，注射安全性大大提高。此外，D-CHO-AmB具有较好的抑菌活性，抑菌圈明显。以上结果表明D-CHO-AmB具有良好的应用前景，它不但可以直接制备成注射剂，也可用于脂质体等新剂型，这为AmB的临床应用提供了更多选择。

[1]HELGA K R，DOLORES R S，MARIA A D，et al.New amphotericin B-gamma cyclodextrin formulation for topical use with synergistic activity against diverse fungal species and Leishmania spp.[J].International Journal of Pharmaceutics，2014，473（1-2）：148-157.

[2]WEN Ye，LIU Hong，TANG Ren，et al.Preparation of amphotericin B magnetoliposomes and quality control[J].Chinese Journal of Hospital Pharmacy，2007，27（10）：1344-1346.（in Chinese）

[3]YANG Zhuoli，YANG Kewei，LI Xinru，et al.Preparation and in vitro release kinetics of amphotericin B-loaded poly（ethyleneglycol）-poly（dl-lac-tide）block copolymer micelles[J].Chinese Pharmaceutical Journal，2007，42（7）：519-523.（in Chinese）

[4]AFZAL H，ABDUS S，IRAM N，et al.Nanocarrier-based topical drug delivery for an antifungal drug[J].Drug Development and Industrial Pharmacy，2014，40（4）：527-541.

[5]TIAN Qingping，LI Peng，WANG Lei，et al.Preparation of amphotericin B microemulsion and its transdermal absorption[J]. Chinese Pharmaceutical Journal，2009，44（4）：283-287.（in Chinese）

[6]HONGBO Y，PARESH C，ZHENG Y Z，et al.Budget impact analysis of liposomal amphotericin B and amphotericin B lipid complex in the treatment of invasive fungal infections in the United States[J].Apply Health Economic Health Policy，2014，12（1）：85-93.

[7]SERRANO D R，LALATSA A，DEA A M A，et al.Oral particle uptake and organ targeting drives the activity of amphotericin B nanoparticles[J].Molecular Phamaceutics，2015，12（2）：420-431.

[8]LIANG Yan，SONG Jiahong，CHEN Jingxiao，et al.Preparation of heparin/chitosan microcapsule for anticoagulation study[J]. Journal of Food Science and Biotechnology，2015，34（3）：295-301.（in Chinese）

[9]LEMARCHAND C，GREF R，COUVREUR P.Polysaccharide-decorated nanoparticles[J].European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2004，58（2）：327-341.

[10]LI Y L，ZHU L，LIU Z Z，et al.Reversibly stabilized multifunctional dextran nanoparticles efficiently deliver doxorubicin into the nuclei of cancer cells[J].Angewandte Chemie International Edition，2010，48（52）：9914-9918.

[11]SUN H L，GUO B N，LI X Q，et al.Shell-sheddable micelles based on dextran-ss-poly（ε-caprolactone）diblock copolymer for efficient intracellular release of doxorubicin[J].Biomacrlmolecules，2010，11：848-854.

[12]CAO Lixia，GUO Xiaona，ZHU Kexue，et al.Preparation of buckwheat protein isolate-dextran conjugates[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2014，33（7）：703-708.（in Chinese）

[13]MEHVAR R.Dextrans for targeted and sustained delivery of therapeutic and imaging agents[J].Journal of Controlled Release，2000，69（1）：1-25.

[14]HUDSON S P，LANGER R，FLINK G R，et al.Injectable in situ cross-linking hydrogels for local antifungal therapy[J]. Biomaterials，2010，31（6）：1444-1452.

[15]XU Shengjing，CAO Shuanglin，XIA Jining，et al.Comparison of broth microdilution and agar dilution methods for antifungal susceptibility testing of Malassezia speciesin vitro[J].Chinese Journal of Dermatology，2011，44（10）：704-707.（in Chinese）

[16]MAIA J，CARVALHO R A，COELHO F J，et al.Insight on the periodate oxidation of dextran and its structural vicissitudes[J]. Polymer，2011，52（2）：258-265.

[17]BRUNEEL D，SCHACHT E.Chemical modification of pullulan：1.Periodate oxidation[J].Polymer，1993，34（12）：2628-2632.

[18]NISHI K K，ANTONY M，MOHANAN P V，et al.Amphotericin B-gum arabic conjugates：synthesis，toxicity，bioavailability，and activities against Leishmania and fungi[J].Pharmaceutical Research，2007，24（5）：971-980.

Preparation and Antibacterial Activities of Dextran-Amphotericin B Conjugates

QIU Lipeng， CAO Ying， ZHU Mengqin， ZHAO Li， CHEN Jinghua*
（School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Three oxidation degree of dextran derivatives（D-CHO）were synthesized with oxidation of sodium periodate.Dextran-amphotericin B （D-CHO-AmB）conjugate was prepared by Schiff's base reaction between aldehyde groups of D-CHO and amino groups of AmB.MALS/GPC results indicated that the molecular weight of dextran was reduced with the increase of oxidation degree. The drug loadings of D-CHO-AmB were 18.9%to 36.7%，which increased with the oxidation degree.Compared with AmB injection，the hemolytic effect of D-CHO-AmB was decreased significantly and the critical concentration of hemolysis was almost tenfold.The inhibition zone test proved that D-CHO-AmB conjugates had an excellent antifungal effect.

amphotericin B，dextran，hemolysis，inhibition effect

R 978

：A

：1673—1689（2017）07—0692—06

2015-07-13

国家自然科学基金项目（21574059）；国家自然科学基金青年基金项目（81503007）。

邱立朋（1984—），男，山东临沂人，理学博士，讲师，主要从事纳米给药系统研究。E-mail：flyqlp@163.com

*通信作者：陈敬华（1971—），男，湖北黄石人，教授，博士研究生导师，主要从事生物功能材料研究。E-mail：jhchenwhut@126.com

邱立朋，曹莹，朱梦琴，等.葡聚糖-两性霉素B的制备及其抑菌活性研究[J].食品与生物技术学报，2017，36（07）：692-697.