单味中药对猪致病性肠道大肠杆菌抑菌作用观察

2017-09-26徐玉刚山东省东平县畜牧兽医局271500

山东畜牧兽医 2017年9期

徐玉刚（山东省东平县畜牧兽医局 271500）

徐玉刚（山东省东平县畜牧兽医局 271500）

无菌采取发病仔猪的新鲜粪便，经细菌的培养、分离、鉴定和小鼠致病性试验，确定为致病性大肠杆菌。将21种中药分别经熬制处理后，制成浓度为1g/ml的药液备用，采用纸片扩散法对分离所得的大肠杆菌进行体外抑菌试验，并检测抑菌效果较强中药的最低抑菌浓度。结果表明，12种单味中药对致病性大肠杆菌具有较强的抑菌作用。

大肠杆菌分离鉴定中药抑菌

猪大肠杆菌病(Colibocillosis)是由致病性大肠杆菌引起的一类仔猪肠道传染病的总称，该病在临床上主要表现为严重腹泻、脱水或败血症，该病严重威胁养猪业发展、公共卫生和动物源性食品的安全[1]。大肠杆菌血清型多，抗原复杂，变异大，菌株易产生广泛的耐药性和多重耐药性，许多中药被证实具有抗菌作用，而且具有成本低、毒副作用小、不易产生抗药性，药物残留量低等特点，在防治感染性疾病方面已初显成效[2]。本试验以21种中药对分离得到的肠道大肠杆菌进行了体外抑菌试验以及最低抑菌浓度测定，以期为中药在防治猪大肠杆菌病方面应用提供理论依据[3]。解决了西药对养殖业引起的大肠杆菌治疗不彻底，并且带有药物残留，使动物引起腹泻，让动物产生耐药性，中药的治疗效果更加彻底，不带有任何的副作用，使养殖更好的得到发展[4]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料采集无菌采集病猪的新鲜粪便适量，装入灭菌试管保存备用。

1.1.2 中药黄连、黄柏、黄芩、大黄、茵陈、连翘、升麻、秦艽、陈皮、青蒿、栀子、白头翁、焦山楂、山楂、蒲公英、枳壳、龙胆草、苍术、柴胡、藿香、葛根21味中药。

1.1.3 主要试剂及培养基葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、MR试验、VP试验、吲哚试验、普通琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、普通肉汤培养基等。

1.1.4 试验动物及仪器健康体重20g左右小白鼠6只。

1.1.5 试验仪器托盘天平、电磁炉、高压蒸汽灭菌锅、冰箱、无菌操作台、离心机、试管、平皿、烧杯、光学显微镜、恒温培养箱、电热鼓风干燥箱等。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的分离、纯化将病料用生理盐水稀释，无菌棉签蘸取涂布于普通琼脂培养基上，37℃恒温培养18～24h；挑取单个菌落接种于麦康凯琼脂板上，37℃恒温培养18～24h；挑取可疑红色中等大小光滑菌落接种于伊红-美蓝琼脂板上，37℃恒温培养18～24h；再挑取一半紫黑色带金属光泽的可疑菌落进行革兰氏染色、镜检，符合大肠杆菌特征的菌株初步确定为大肠杆菌，另一半接种到普通琼脂斜面培养基上，37℃培养18～24h，以备进行生化试验。

1.2.2 分离菌的生化鉴定对分离的细菌进行糖发酵试验(葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖)、MR试验、VP试验、吲哚试验，24～48h后观察结果。

1.2.3 猪大肠杆菌的致病性试验经生化试验筛选出来的大肠杆菌接种于普通肉汤培养基上，37℃培养18～24h，稀释至菌浓度1.5×108CFU/ml备用。取健康小鼠6只，随机分成试验组和对照组，试验组腹腔注射菌液0.2ml/只，对照组腹腔注射灭菌的生理盐水0.2ml/只，72h后观察小鼠的死亡情况。

1.2.4 药液制备 21味单味中药各取10g，加蒸馏水100ml室温浸泡30min后煮沸，再换文火加热至1001h℃，过滤，滤渣加水100ml文火加热30min，过滤，2次滤液合并浓缩至1g/ml，离心取上清液，121℃灭菌15min，将药液无菌分装入青霉素小瓶内并贴上药物名称标签，4℃冰箱保存备用。

1.2.5 药敏纸片的制备将已用打孔器打好的6mm小滤纸圆片高压灭菌，于无菌操作台上用无菌镊子分别夹入20片小滤纸圆片至各青霉素小瓶内，充分浸泡24h放入4℃冰箱中保存备用。

1.2.6 药敏试验用纸片扩散法进行药敏试验：用无菌棉签蘸取菌液涂抹于琼脂平板中，用无菌镊子夹取药敏纸片均匀贴在培养基上，37℃培养24h，测定抑菌圈直径，取其平均值。

1.2.7 最低抑菌浓度的测定筛选出对致菌株具有较好抑制效果的中药，采用试管2倍稀释法，测定各中药最小抑菌浓度，同时设无药菌液对照管和纯中药对照管，把各管内容物37℃培养24h观察结果。若培养液透明则直接判定结果；若培养液色泽较深不易判定结果，则培养结束后，将培养液适量接种固体培养基划线培养18～24h，观察结果，以无菌生长的最低稀释度为各药MIC[8]。

2 结果

2.1 细菌染色、镜检结果

该菌为两端钝圆、无芽孢、无荚膜、呈短杆状菌、单个散在或成对存在、两端着色较深、革兰氏染色阴性。

2.2 生化试验结果

生化试验结果表明：葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇既产酸又产气，蔗糖、VP试验结果为阴性，吲哚试验和MR试验结果为阳性。

2.3 大肠杆菌致病性试验结果

接种分离菌的小白鼠后，3只小白鼠均死亡，对死亡的小鼠立即解剖，经剖检无菌取其脏器划线于伊红美蓝琼脂培养基上进行接种菌回收试验，染色、镜检，证明与原分离菌特征一致，对照组小白鼠无异常。

2.4 药敏试验结果

表1表明：白头翁、黄连、黄柏、大黄、连翘、栀子、山楂、焦山楂具有较高的敏感性，黄芩、蒲公英、苍术、藿香具有中度敏感性。

表1 中药抑菌圈直径及其敏感性 (mm)

2.5 最低抑菌浓度结果

表2 抑菌效果好的中药最低抑菌浓度 (g/ml)

表2表明：不同单味中药1株致病菌的最低浓度存在差异，其中黄连、大黄、栀子的最低抑菌浓度为62.5g/ml。

3 讨论

（1）本试验中，为确保分离菌株准确性和可靠性，先后通过菌落形态观察、革兰氏染色镜检、选择性鉴别培养、各种生化反应以及动物致病性试验等，保证了从发病仔猪的粪便中分离的3株细菌为致病性大肠杆菌。动物致病性试验结果表明，本试验分离的2株菌均能在24h内致死试验小白鼠，致死率达100%，提示分离的大肠杆菌致病性很强，这进一步为该病的诊断提供了可靠依据[5]。（2）中药对大肠杆菌的抑制效果本试验结果表明，单味中草药对致病菌的体外抑制效果普遍较弱，但黄芩、黄连、黄柏、连翘、等药物抑菌效果较明显，其共同点在于都具有清热解毒、泻火燥湿的功用。陈皮、葛根、青蒿等几乎无抑菌作用，可能与实际结果存在一定差异，这可能与提取方法有关，也可能与菌种来源、种类及中药产地、批次等各方面的差异有关。同时，在单味药物中，“三黄”也表现出良好的抗菌活性，表明在抗菌、消炎等方面中药黄芩、黄连、黄柏都具有较高的开发价值。MIC值可作为兽医临床选用抗菌药物的主要依据。测定单味中药MIC值时可以使中药使用时更合理、更简单、更科学，在生产中的实际运用效果可做进一步研究，使其在治疗猪肠道疾病方面具有广阔的应用前景。