ClC-3基因敲除小鼠的构建及鉴定

余杰，毛建文，徐彬

1.广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东广州 510006；2.广东药科大学基础学院，广东广州 510006

ClC-3基因敲除小鼠的构建及鉴定

余杰1，毛建文2，徐彬1

1.广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东广州 510006；2.广东药科大学基础学院，广东广州 510006

目的 构建并鉴定ClC-3基因敲除小鼠，为研究ClC-3氯通道蛋白的生物学功能提供动物模型。 方法 将从2015年9月—2016年9月选取的6只赛业生物科技有限公司 (广州)构建的ClC-3flox/+小鼠与2只Jackson实验室引进的Ubc-Cre小鼠进行杂交繁殖，得到基因型为ClC-3flox/flox-Cre+及ClC-3flox/+-Cre+的小鼠。取鼠尾DNA，通过PCR法鉴定子代小鼠的基因型。结果 子代小鼠基因组DNA结果显示在357 bp与100 bp处均有条带，符合预期结果。 结论 该研究基于Cre/Loxp系统，利用loxp转基因的ClC-3flox/+小鼠和在全身表达 Cre重组酶的Ubc-Cre小鼠，成功构建并鉴定了ClC-3基因敲除小鼠。

ClC-3；基因敲除；Cre/Loxp系统

课题组自 2000年开始从事 ClC-3蛋白的生物学功能研究，致力于获得 ClC-3氯通道蛋白参与某些疾病的实验证据。有研究表明ClC-3氯离子通道参与了细胞的转运[1]、增殖[2-3]、迁移[4-8]、凋亡[9]等过程，另外，一些疾病的发生发展也与ClC-3有着密不可分的联系[10-17]，例如其在肿瘤组织中高表达[18-19]，且在不同病理分级之间存在明显差异[20]。因此，成功构建ClC-3基因敲除小鼠，为研究ClC-3基因与某些疾病的相关性提供动物模型具有重要的意义。现已有实验室成功构建组织特异性ClC-3敲除小鼠模型用于疾病研究，例如，肠特异性敲除ClC-3会加重炎症性肠病[20]，心脏特异性敲除 ClC-3基因会导致成年鼠心肌肥厚。但目前还没有实验室构建条件性ClC-3敲除小鼠，该课题组从2015年9月—2016年9月，利用6只loxp转基因的ClC-3flox/+小鼠和2只在全身表达 Cre重组酶的Ubc-Cre小鼠，成功繁育出条件性ClC-3敲除小鼠21只，为进一步研究ClC-3与某些疾病的相关性提供实验条件。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验动物 Ubc-Cre工具鼠由美国Jackson实验室引进 (Stock Number:007179，StrainName:129S.Cg-Tg(UBC-cre/ERT2)1Ejb/J，品系背景为C57BL/6J，雄性2只，基因型为杂合子(+/-)。ClC-3基因敲除小鼠委托赛业生物科技有限公司(广州)构建，编号为001_mClcn3_1H12,品系背景为C57BL/6J，雌雄各3只，基因型为杂合子(+/-)。同时自中山大学实验动物中心购进野生型C57BL/6J鼠雌性15只、雄性1只用于保种扩群。

1.2 实验材料

鼠尾基因组DNA提取试剂盒 （目录号：CW2094）购自康为世纪有限公司，Taq酶 (DRR037S)、DNA marker DL1000(D526A)、琼脂糖（BIOWEST）购自大连宝生物工程有限公司，EB替代物溶液购自北京普利莱基因技术有限公司。小鼠鉴定引物由上海Invitrogen公司合成，见表1。

1.3 敲除小鼠的繁殖、信息记录

3月龄杂合flox小鼠、Cre工具小鼠及野生型小鼠于SPF环境下饲养[SYXK(粤)2012-0125]，紫外2 h/d，温度22～28℃，湿度 40%～60%，明暗循环12 h/d，自由饮食和饮水。小鼠饲料及垫料均购自广东药科大学实验动物中心，笼盒、垫料、饮用水均经高温高压灭菌处理。饲养过程中，进入动物房1次/d补充饲料和饮用水，观察小鼠生长情况，垫料更换3次/周。小鼠2个月后性能力发育成熟，将其雌雄3:1同笼合养，定期给予灭菌葵花籽以增强其繁殖能力。雌性小鼠的妊娠期和哺乳期为3周左右，记录其分娩时间、仔鼠数量，并于哺乳期后将小鼠与母鼠分开，雌雄分开饲养，待小鼠成年用于鉴定。flox杂合小鼠（ClC-3flox/+）自交所得F1代有flox纯合小鼠（ClC-3flox/flox）、flox杂合小鼠（ClC-3flox/+）及野生型小鼠（ClC-3+/+），据孟德尔定律，概率分别为1/4、1/2、1/4。同时由flox杂合小鼠（ClC-3flox/+）与Cre工具小鼠（Cre+）交配获得杂交系F1代有flo x杂合伴Cre阳性小鼠 （ClC-3flox/+-Cre+），flox杂合小鼠（ClC-3flox/+），Cre工具小鼠（Cre+），野生型小鼠（ClC-3+/+），概率分别为1/4。最后由所得的flox纯合小鼠（ClC-3flox/flox）与 flox杂合伴 Cre阳性小鼠（ClC-3flox/+-Cre+）杂交得到flox纯合伴 Cre阳性小鼠（ClC-3flox/flox-Cre+），flox杂合伴Cre阳性小鼠 （ClC-3flox/+-Cre+），flox纯合小鼠（ClC-3flox/flox），flox杂合小鼠（ClC-3flox/+），概率分别为1/4。其中flox纯合伴Cre阳性小鼠（ClC-3flox/flox-Cre+），flox杂合伴 Cre阳性小鼠（ClC-3flox/+-Cre+）即实验所需。

1.4 小鼠的基因型鉴定

1.4.1 小鼠组织DNA的提取 将小鼠尾部组织小段 （长0.5～1.0 cm）置入1.5 mL Eppendolf管，按照TailGen DNA Kit鼠尾基因组DNA提取试剂盒 （CW2094）说明进行操作，提取DNA。

1.4.2 PCR反应 利用ClC-3基因敲除鼠和Ubc-Cre工具鼠特异性引物(如表1)进行PCR扩增。ClC-3基因敲除鼠PCR体系总体积25 μL，分别加入Premix Taq酶12.5 μL，PCR引物各0.8 μL，模板DNA1.5 μL，ddH2O 9.4 μL。注：引物浓度为10 μM。反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，退火60℃ 35 s，延伸72℃35 s，循环32次，72℃延伸5min，4℃保存。Ubc-Cre工具鼠PCR体系总体积12 μL，分别加入Premix Taq酶4.81 μL,目的基因及内参引物各1.2 μL，模板DNA2 μL，ddH2O 2.79 μL。注：引物浓度为10 μM。反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，退火51.7℃1 min，延伸72℃1 min，循环35次，72℃延伸2 min，4℃保存。

表1 基因型鉴定的引物信息表

1.4.3 琼脂糖电泳及成像分析 取10 μLPCR产物进行3%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统分析结果。

2 结果

2.1 小鼠繁殖情况

成年ClC-3 flox母鼠与表达Cre重组酶的母鼠成功繁殖出子代幼鼠。每只母鼠孕期为19～21 d，哺乳期18～23 d，产后3周离乳。每胎平均产6～10只幼鼠，成活率＞95%，新生小鼠呈肉色，无毛，闭眼，尾短，四肢柔弱，平均断乳期21 d。成年小鼠成熟期：雄性10周，雌性8周，体重、活力相对C57BL/6J没有较大差别，但繁殖能力相对弱，容易出现食仔、脱毛等现象。12个月共繁育小鼠2代/次，得到F2代小鼠39只，经基因型鉴定，获得flox纯合伴Cre阳性小鼠 （ClC-3flox/flox-Cre+）9只，flox杂合伴Cre阳性小鼠 （ClC-3flox/+-Cre+）12只，flox纯合小鼠 （ClC-3flox/flox）8只，flox杂合小鼠（ClC-3flox/+）10只，纯合小鼠比例为23%，基本符合孟德尔遗传定律。

2.2 ClC-3基因敲除鼠鉴定结果

F2代基因敲除小鼠有 flox纯合伴 Cre阳性小鼠（ClC-3flox/flox-Cre+），flox杂合伴 Cre阳性小鼠 （ClC-3flox/+-Cre+），flox纯合小鼠 （ClC-3flox/flox），flox杂合小鼠（ClC-3flox/+）4种基因型。Loxp位点验证，如图 1所示，1、2、3、4、6号小鼠电泳条带位于357 bp和287 bp处为杂合子；5、8号小鼠电泳条带位于357 bp处为纯合子；7号小鼠电泳条带位于287 bp处为野生型。Cre位点验证，如图2所示，3、4、5、6、7号小鼠电泳条带位于100 bp是为有Cre位点。综上，实验所需flox纯合伴Cre阳性小鼠（ClC-3flox/flox-Cre+）为5号，flox杂合伴Cre阳性小鼠（ClC-3flox/+-Cre+）为3、4、6号。

图1 ClC-3 flox小鼠基因型鉴定结果

图2 表达UBC-Cre重组酶的小鼠基因型的鉴定结果

2.3 小鼠生长发育情况

flox纯合伴Cre阳性小鼠 （ClC-3flox/flox-Cre+），flox杂合伴Cre阳性小鼠（ClC-3flox/+-Cre+）毛色、体重、活力相对野生型C57BL/6 J整体没有较大差别，见图3。病理学检查结果显示，部分组织如脑、肾脏、脾脏的形态结构，flox纯合伴 Cre阳性小鼠 （ClC-3flox/flox-Cre+）相对C57BL/6J未见明显异常，见图4。

图3 不同基因型小鼠形态对比

图4 不同基因型小鼠的部分组织比较（HE，×100）

3 讨论

随着基因组学研究的深入，基因敲除技术日渐成熟，Zhen等[21]通过 RNA干扰技术成功抑制猪颗粒细胞中CEBPβ基因表达。2012年，余华等[22]利用双臂同源重组法成功对铜绿假单胞菌内弹性蛋白基因进行了敲除。Liu等[23]采用 TALENs技术对对果蝇染色体上的基因进行了修饰。该文所述的条件性基因敲除是利用Cre／Loxp重组系统介导基因打靶的方法。Cre重组酶由Cre基因编码，可识别特异DNA序列，如Loxp位点，切掉Loxp位点之间的靶基因和一个Loxp位点，从而达到靶基因敲除的目的。通过显微注射法把两个同向排列的LoxP位点插入到胚胎干细胞基因组靶位点的一个或几个重要外显子的两端以制备出floxed小鼠，即文中所提ClC-3flox/+鼠，基因组DNA结果显示在357 bp处有条带，该floxed小鼠在与表达Cre重组酶小鼠杂交之前，该目的基因表达完全正常，若floxed小鼠与组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其它组织或细胞表达正常，该实验所杂交对象为全身表达Cre重组酶的Ubc-Cre工具小鼠，DNA结果显示在100bp处有条带，可对ClC-3进行全身敲除。

ClC-3，基因符号为CLCN3，作为ClC电压门控性氯离子通道家族中的重要一员，对于保持膜腔内电中性调节细胞体积有重要作用。有研究表明，心脏特异性敲除ClC-3基因，可以导致心肌肥大甚至心衰[24]，此外，ClC-3在胃肠道黏膜保护、血管重塑[25]、成骨细胞的矿化和骨形成过程中也起到重要作用[26-27]，也有研究表明某些基因的完全性敲除小鼠致死率极高[28]，难以进行该基因功能的相关性研究。因此，构建全身敲除ClC-3基因的小鼠并于成年后诱导敲除对于进一步深入研究ClC-3的功能极为重要，该实验构建的敲除小鼠未经他莫昔芬诱导时生长发育良好，且病理检查未见异常，能够用于后续实验。根据Cre／Loxp条件性基因敲除技术原理，只有基因型为ClC-3 flox/flox-Cre+的纯合小鼠于成年后经他莫西芬诱导ClC-3基因完全敲除，而其他类型的小鼠体内ClC-3基因则正常存在。例如基因型为ClC-3flox/+-Cre+的杂合子敲除小鼠仍有可能对某些细胞的功能产生影响。本实验成功构建ClC-3基因敲除纯合子、杂合子小鼠用于深入研究ClC-3的结构、功能及与某些疾病的相关性。

综上所述，基于Cre/Loxp系统，利用loxp转基因的ClC-3flox/+小鼠和在全身表达 Cre重组酶的Ubc-Cre小鼠，本实验室成功构建ClC-3基因全身敲除小鼠,并通过PCR技术从基因表达水平上完成了鉴定。ClC-3全身敲除小鼠在生长速度、繁殖能力等方面与野生型小鼠无明显差异。到目前为止培育杂交子代小鼠共20多只，下一步待小鼠发育成熟后通过他莫西芬诱导其ClC-3全身敲除，并利用该敲除鼠，探讨局部给药诱导实现组织特异性敲除，观察ClC-3敲除对高表达ClC-3的组织功能是否有影响。

综述所述，条件性ClC-3基因全身敲小鼠的成功构建，为ClC-3在组织器官生理病理的功能研究提供了良好的实验材料基础。

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Construction and Identification of ClC-3 Knockout Mouse

YU Jie1,MAO Jian-wen2,XU Bin1
1.College of Life Science and Pharmaceutical Engineering,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou,Guangdong Province,510006 China；2.Academic College,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou,Guangdong Province,510006 China

Objective To construct and identify the ClC-3 knockout mouse and provide the animal model for researching the biology function of ClC-3 chloride channel protein.Methods 6 ClC-3flox/+mice constructed by the Saiye biotechnology Co.Ltd (Guangzhou)and 2 Ubc-Cre mice introduced by Jackson laboratory were selected from September 2015 to September 2016 were selected for interbreeding thus obtaining the lC-3flox/flox-Cre+and ClC-3flox/+-Cre+mice,Results The generation mice gene was identified by PCR method.The DNA results in the general mice gene group showed that there were stripes at 357 bp and 100 bp,meeting the expected results.Conclusion The paper successfully constructs and identifies the ClC-3 knockout mouse by using the loxp transgenosis ClC-3flox/+mice and Ubc-Cre mice with cre recombinase in expression of the whole body based on the Cre/Loxp system.

ClC-3;Knockout;Cre/Loxp system

R4

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2017.03.01.04

2016-12-15；

2017-01-07

国家自然科学基金：ClC-3氯通道蛋白非离子通道途径调控膜皱褶和有丝分裂的研究（31371144）；广东省自然科学基金：氯通道阻断剂NPPB抑制术后腹膜粘连的研究（2016A030313741）。This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（31371144）and the?Natural Science Foundation of Guangdong Province（2016A030313741）.

余杰（1992.7-），女，湖北宜昌人，硕士，研究方向：离子通道蛋白功能及其靶向药物筛选。

徐彬（1975.11-），女，四川眉山人，博士，教授，研究方向：离子通道蛋白功能及其靶向药物筛选，肿瘤分子生物学与基因治疗。E-mail：xubin2003@163.com。