清热祛瘀方对慢性盆腔炎模型大鼠血流动力学及免疫分子的影响*

2017-09-23王新斌薛淑萍马睿玲刘峰林颜春鲁吴国泰

中医研究 2017年9期

关键词：盆腔炎中医药大学动力学

王新斌，薛淑萍，马睿玲，刘峰林，颜春鲁，吴国泰

(1.甘肃中医药大学, 甘肃兰州 730000； 2.兰州市中医院妇产科，甘肃兰州 730000)

·实验研究·

清热祛瘀方对慢性盆腔炎模型大鼠血流动力学及免疫分子的影响*

王新斌1，薛淑萍2，马睿玲1，刘峰林1，颜春鲁1，吴国泰1

(1.甘肃中医药大学, 甘肃兰州 730000； 2.兰州市中医院妇产科，甘肃兰州 730000)

目的:探讨清热祛瘀方对慢性盆腔炎模型大鼠血流动力学及免疫分子的作用。方法: 将60只Wistar雌性大鼠随机分为假手术组，模型对照组，清热祛瘀方高(21.0 g/kg)、中(10.5 g/kg)、低(5.3 g/kg)剂量组及金刚藤胶囊组(0.63 g/kg )6组。除假手术组外,其他各组通过苯酚胶浆注入大鼠子宫法建立盆腔炎大鼠模型。造模成功后第8天开始，依据人与大鼠用药量换算方法[4]计算用药量，金刚藤组灌胃给予金刚藤溶液 0.63 g/kg，清热祛瘀方高、中、低剂量组依次灌胃给予清热祛瘀方 21.0，10.5 ，5.3 g/kg，模型对照组及假手术组蒸馏水给予10μL/g灌胃，1 d 1 次，共4周。检测大鼠子宫肿胀程度、血流动力学、血清白介素(IL-10)与肿瘤坏死因子(TNF-α)及免疫球蛋白(IgG、IgA)的影响。结果:清热祛瘀方可明显缓减子宫组织病理变化而减轻子宫水肿，降低血清TNF-α含量水平，提高血清IL-10、IgG、IgA的表达；同时，还能明显改善血流动力学的相关指标(P<0.05)。结论:清热祛瘀方能调节免疫分子及改善大鼠血流动力学，减轻盆腔炎子宫水肿及病变，这可能是其防治盆腔炎的机制之一。

清热祛瘀方/药效学；盆腔炎；血流动力学；IL-10；TNF-α； IgA； IgG；子宫肿胀度；肿胀抑制率；动物；大鼠

盆腔炎(pelvic inflammatory diseases,PID)[1]是指女性生殖器包括子宫、输卵管、卵巢及其周围的结缔组织、盆腔腹膜炎症的总称，是性活跃期女性常见的上生殖道感染性疾病。若急性期治疗不彻底、炎程迁延或病人体质差，会形成慢性型盆腔炎(chronic pelvic inflammatory disease,CPID)。依据盆腔静脉丛解剖学特点，CPID多形成盆腔静脉曲张，发展为盆腔淤血综合征，对女性的身心健康造成严重影响。清热祛瘀方是甘肃中医药大学附属医院妇科用于治疗慢性盆腔炎的协定方剂，目前对该方的研究只限于临床疗效观察和药效动力学研究。本研究通过复制盆腔炎大鼠模型，观察清热祛瘀方对慢性盆腔炎模型大鼠血流动力学及免疫分子的影响，进一步探讨其治疗慢性盆腔炎的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级Wister雌性大鼠，鼠龄10～14周，体质量(215.82±16.26) g，由甘肃中医药大学动物实验中心提供，实验动物合格证号：SCXK(甘) 2004-0006-0000010。

1.2 药品、试剂与仪器

清热祛瘀方由红藤、土茯苓、野菊花、乳香、没药、延胡索、五灵脂、丹参、赤芍、当归、白芷组成。药材来源于甘肃中医药大学炮制实验室，经甘肃中医药大学中药炮制室刘峰林博士鉴定，质量符合《中国药典》要求。分别加2，4倍量水浸泡 2 h，煎煮 20，30 min，过滤合并滤液，浓缩至规定质量分数，冷藏，备用。金刚藤胶囊，湖北福人药业股份有限公司产品，批号20150851；水合氯醛，中国白鹤化工厂产品，批号980101。TNF-α、IL-10、IgA、IgG酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒，上海易莎生物科技有限公司产品，批号E20160301A。电子计价秤，广东香山有限公司产品；80-1型离心机(4 000转/min)，上海云楼医用仪器厂产品；BCD-290W冰箱，青岛海尔股份有限公司产品；Tecan Infinite M200 PRO多功能酶标仪，Tecan集团奥地利有限公司；HHS-2S型恒温水浴锅，上海江仪仪器有限公司；10～1 000 μL Thermo4640060型移液枪, 赛默飞世尔科技(芬兰)有限公司；LG-R-80A型全自动血液黏度仪，北京中勤世帝科学仪器有限公司产品。

1.3 动物分组、模型的建立与给药

将60只雌性大鼠按体质量随机分为假手术组，模型对照组，清热祛瘀方高(21.0 g/kg)、中(10.5 g/kg)、低(5.3 g/kg)剂量组及金刚藤胶囊组(0.63 g/kg)6 组，每组10只，适应性饲养1周。按照文献[2-3]方法建立慢性盆腔炎动物模型，方法如下：将大鼠用 100 g/L 水合氯醛麻醉，仰卧固定，下腹部手术部位去毛，常规消毒；沿腹中线于尿道口上方 1 cm 处向上切口 0.8～1.0 cm，暴露右侧子宫，距卵巢 2 cm 处用5号针头小心进针划伤子宫，相同力量机械划伤同侧子宫5次后，分别向右侧输卵管-卵巢方向向卵巢方向缓慢注入 250 g/L苯酚胶浆溶液 0.05 mL，分层关腹。假手术组只切开腹部，暴露子宫后直接进行关腹处理。术后常规饲养7 d。造模成功后第8天开始，依据人与大鼠用药量换算方法[4]计算用药量，金刚藤组灌胃给予0.63 g/kg金刚藤，清热祛瘀方高、中、低剂量组依次灌胃给予21.0，10.5 ，5.3 g/kg 清热祛瘀方，模型对照组及假手术组蒸馏水给予10 μL/g 灌胃，1 d 1 次，共4周。

1.4 检测指标

1.4.1 血流动力学

末次给药24 h后，将禁食、不禁水16 h的动物用 100 g/L 的水合氯醛 350 μg/g腹腔麻醉，剖腹，股动脉采血 6 mL，置于含有125单位肝素抗凝管中。取肝素抗凝的全血 0.8 mL于全自动血液流变仪上测定全血黏度的高切、中切、低切值，红细胞比容。将剩余的全血离心(2 500 r/min 离心10 min，分离血清及血浆，-20 ℃保存备用)，取 0.8 mL 血浆于全自动血液流变仪上测定血浆黏度。

1.4.2 血清IL-10、TNF-α、IgA、 IgG含量

取-20 ℃保存备用的血清按照参考文献[5]，采用ELISA试剂盒法检测大鼠血清IL-10、TNF-α、IgA和IgG，操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.3 大鼠子宫肿胀度、肿胀抑制率

采血后处死大鼠，摘取双侧子宫及输卵管，除去脂肪组织，称量质量，放入100 mL /L的甲醛固定液中保存[6]。子宫肿胀度(g)= 右侧子宫质量-左侧子宫质量。肿胀抑制率(%)=(模型对照组肿胀度-给药组肿胀度)÷模型对照组肿胀度×100%。

1.4.4 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠血流动力学指标对比

与假手术组对比，模型对照组大鼠的血浆黏度，全血高切、中切、低切值和红细胞比容均增高，差别有统计学意义(P<0.05),说明模型大鼠血液处于血瘀状态。与模型对照组对比，清热祛瘀方各剂量组和金刚藤组大鼠血浆黏度，全血高、中、低切黏度，红细胞比容均不同程度降低，差别有统计学意义(P<0.05)。清热祛瘀方高剂量组上述5个指标较金刚藤组差别有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 清热祛瘀方对盆腔炎大鼠血流动力学的影响

注：与模型对照组对比，*P<0.05；与金刚藤组对比，#P<0.05。

2.2 各组大鼠血清IL-10、TNF-α含量对比

与假手术组对比，模型对照组大鼠血清IL-10下降，TNF-α升高，差别有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比，清热祛瘀方各剂量组IL-10明显升高，TNF-α下降，差别有统计学意义(P<0.05)。清热祛瘀方各剂量组的IL-10、TNF-a较金刚藤组差别无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清IL-10、TNF-α含量对比

注：与模型对照组对比，*P<0.05。

2.3 各组大鼠血清IgA、IgG 含量对比

与假手术组对比，模型对照组大鼠血清IgA、IgG降低，差别有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比，清热祛瘀方各剂量组血清IgA、IgG含量均有不同程度的升高，其中，高剂量组较之差别有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清IgA、IgG 含量对比

注：与模型对照组对比,*P<0.05。

2.4 各组大鼠大鼠子宫肿胀程度、肿胀抑制率对比

与假手术组对比，模型对照组大鼠右侧子宫质量和子宫肿胀度增加，差别有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比，清热祛瘀方各剂量组右侧子宫质量和子宫肿胀度减轻，差别有统计学意义(P<0.05)。清热祛瘀方各剂量组的右侧子宫质量和子宫肿胀度较金刚藤组差别有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠子宫肿胀程度、肿胀抑制率对比

注：与模型对照组对比,*P<0.05；与金刚藤组对比,#P< 0.05

3 讨论

慢性盆腔炎常为急性盆腔炎未能彻底治疗，或患者体质弱，病情顽固，反复不愈，迁延所致[7],属中医学“妇人腹痛”“癥瘕”“不孕”等病证范畴，以湿热瘀结证型最为多见。患者的舌质多红、有瘀点瘀斑，舌苔多黄腻，脉象弦、滑，反映体内“湿”“热”“瘀”的存在[8]，因此治疗该病多用清热利湿、活血化瘀之法。《素问·太阴阳明论》曰：“伤于湿者，下先受之。”湿性下趋，故多侵阴位，流注下焦，湿邪内郁，日久化热，湿热内蕴，阻滞冲任气血，致气滞血瘀、胞脉气血运行不畅而发病。故该病标象为湿热，血瘀贯穿始终，清热利湿、祛瘀通络为治疗大法。方中红藤、土茯苓、野菊花清热解毒、活血散瘀通络，配以黄柏增强清热之效。当归、丹参、赤芍、乳香、没药、五灵脂合奏行气活血、消肿止痛之效，与白芷相佐，通滞散结。延胡索辛散温通，即能入血分，又能入气分，能治一身诸痛。赤芍辅助丹参活血化瘀、调经止痛，取其活血祛瘀之功并寓清热凉血之意，以防瘀久化热；同时，赤芍具有较强的抗炎作用，能抑制炎症细胞浸润，恢复黏膜上皮细胞功能，增强细胞分泌活动，促进炎症介质前列腺素的降解。现代药理研究[9]表明：丹参有促纤溶作用，可使纤维蛋白溶解，起到缓解组织粘连的作用，并且对血小板聚集有一定的抑制作用，从而达到抗凝血作用；当归可降低血小板聚集，促进非特异性免疫功能，有增强单核巨噬细胞吞噬功能的作用，且其挥发油有抗炎、抗过敏及抗菌的作用。诸药合用，共奏清热利湿、活血化瘀、理气止痛之效。

盆腔血液循环障碍被认为是慢性盆腔炎久治不愈、反复发作的原因之一。血流动力学指标反映血瘀的程度。临床研究已证实：大部分 CPID 患者存在不同程度的血流动力学异常，即血液常处于黏、浓、凝、聚的状态[10]。本研究中，清热祛瘀方治疗组血浆黏度和全血低切/高切黏度均显著低于模型对照组，且不同程度改善了子宫及输卵管的肿胀程度，这可能与本方运用大量活血化瘀药的同时配伍少量清热药有关，改善了组织局部血流动力学，提高了临床疗效，彰显了中医药多靶点治疗疾病的特色。

西医学研究发现：部分慢性盆腔炎在慢性发展过程中已无病原体的存在，慢性阶段的病理改变是继细菌感染后引起组织充血、水肿、毛细血管通透性增强，炎性物质渗出，造成局部组织粘连、功能损伤，刺激机体所发生的免疫反应所致，与细胞因子、炎症介质等因素的异常改变有关。IL-10主要由Th2细胞产生，可抑制促炎症细胞因子的产生与释放，抑制炎性细胞因子引起的过强免疫反应，从而降低自身免疫应答，促进组织的修复和重建。TNF-α是影响机体炎症进程的主要炎性因子之一，是一种由活化单核巨噬细胞、肥大细胞及活化的T淋巴细胞等多种炎症细胞产生的具有广泛生物活性的炎性前细胞因子，参与炎症反应，在炎症反应中起核心作用，是启动炎症的重要细胞因子。据文献[11]报道：慢性盆腔炎模型大鼠血清IL-10水平显著降低，大鼠血清TNF-α水平显著升高。本研究中模型对照组大鼠血清IL-10水平较假手术组降低、大鼠血清TNF-α水平升高(P<0.05)，与文献报道一致，提示机体促炎因子分泌和释放亢进、抗炎因子分泌和释放减少，使机体促炎与抑炎因子失衡，炎症在体内不断蔓延发展，组织损伤进一步加重。经清热祛瘀方治疗后，大鼠血清IL-10水平明显升高(P<0.05)，大鼠血清TNF-α水平显著下降(P<0.05)，提示清热祛瘀方治疗盆腔炎的机制可能是通过提高细胞免疫反应，降低外周血单核细胞和巨噬细胞分泌的TNF-α对单核细胞、淋巴细胞的趋化作用而减轻炎细胞对组织的浸润来实现的。

免疫球蛋白是体液免疫的主要组成部分。免疫球蛋白IgA、IgG、IgM 是一类存在于人体血液或体液中有抗体活性的蛋白质，具有抗菌、抗病毒作用，并能在补体协同作用下杀死或溶解病原微生物，是机体抗感染免疫中的重要防御机制。本研究结果显示:清热祛瘀方能不同程度地促进了IgA、IgG的产生。表明：清热祛瘀方能调节体液免疫，抑制机体变态反应(湿邪形成)的不断发生，发挥抗炎、抗感染(热邪)作用，从而有利于炎症(湿热)的减轻。

综合上述，清热祛瘀方可通过改善血流动力学来改善机体局部组织粘连及水肿状态；提高抗炎细胞因子含量，抑制炎症的发展促进组织再生和修复；增强机体的的免疫功能，从而达到“正气内存，邪不可干”的目的。这可能是清热祛瘀方治疗CPID的机制之一。

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