补肾中药温肾强身散对去卵巢大鼠骨代谢和OPG/RANKL平衡的影响*

杨博文，颜春鲁，王 鹏，马正民，牛彦强

(1.甘肃中医药大学中医临床学院，甘肃 兰州730000； 2.甘肃中医药大学教学实验实训中心，甘肃 兰州730000； 3.甘肃中医药大学临床医学院，甘肃 兰州730000)

·实验研究·

补肾中药温肾强身散对去卵巢大鼠骨代谢和OPG/RANKL平衡的影响*

杨博文1，颜春鲁2，王 鹏1，马正民1，牛彦强3

(1.甘肃中医药大学中医临床学院，甘肃 兰州730000； 2.甘肃中医药大学教学实验实训中心，甘肃 兰州730000； 3.甘肃中医药大学临床医学院，甘肃 兰州730000)

目的：观察补肾中药温肾强身散对去势骨质疏松大鼠骨代谢和OPG/RANK/RANKL含量的影响，探讨补肾中药温肾强身散治疗骨质疏松的作用机制。方法：将60只SPF级雌性SD大鼠随机分为模型对照组，戊酸雌二醇组，温肾强身散高、中、低剂量组和假手术组。除假手术组外，其余各组大鼠行双侧卵巢去除术，假手术组大鼠行假手术处理。戊酸雌二醇组给予雌激素戊酸雌二醇片0.09 μg/g体质量灌胃治疗，假手术组和模型对照组大鼠给予等体积蒸馏水灌胃，温肾强身散高、中、低剂量组依次给予8，16，32 g/kg温肾强身散溶液10 μL/g体质量灌胃治疗，1 d 1次，连续4周。观察大鼠的一般状况，记录末次给药体质量；检测血清骨钙素(osteocalcin，BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，trACP)、护骨素(osteoprotegerin ，OPG)、核因子b受体激活剂(receptor activator of nuclear factor κB，RANK )和核因子b配体受体激活剂(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)含量；双能X骨密度仪分析测定大鼠股骨骨密度(bone mineral density，BMD)；AG-IX生物力学万能实验机检测断裂载荷和定伸长-位移。结果：与假手术组对比，模型对照组和各干预组大鼠体质量明显升高，血清trACP、RANK和RANKL含量均明显升高(P<0.05)；而模型对照组大鼠血清BGP和OPG明显降低，BMD明显减少，断裂载荷和定伸长-位移明显减少(P<0.05)。与模型对照组相比，温肾强身散各剂量组血清trACP、RANK和RANKL含量均降低，股骨的骨微观参数BMD均得到了良好地修复，骨生物力学参数中断裂载荷、定伸长-位移得到了明显修复(P<0.05)；而温肾强身散中、高剂量组血清BGP和OPG明显升高(P<0.05)。结论：补肾中药温肾强身散能够调控去卵巢骨质疏松症大鼠的骨代谢和股骨的生物力学性能，可能是通过OPG/RANK/RANKL调节轴实现的。

温肾强身散/药效学；骨质疏松；骨代谢；OPG/RANK/RANKL；动物；大鼠

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种起病隐匿，以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨脆性增加、易于骨折的慢性代谢性骨病[1]。性激素分泌减少，钙调节激素分泌失调，蛋白质、钙、磷、维生素、微量元素摄入不足，户外运动减少是导致中、老年人易患OP的重要原因[2-3]。如何防治骨质疏松成为医学者关注的焦点。本课题以SD雌性大鼠为实验对象，采用去卵巢法建立骨质疏松症模型，通过检测血清骨钙素(osteocalcin，BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，trACP)、护骨素(osteoprotegerin ，OPG)、核因子b受体激活剂(receptor activator of nuclear factor κB，RANK)、核因子b配体受体激活剂(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)含量，股骨骨密度(bone mineral density，BMD)，断裂载荷和定伸长-位移变化，进一步探讨补肾中药温肾强身散在体内抗骨质疏松症的作用机制，为临床研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF级SD雌性大鼠60只，体质量(180±20) g，由甘肃中医药大学科研实验动物中心提供。实验动物质量合格证编号：SCXK(甘)2011-0001。

1.2 药品、试剂与仪器

温肾强身散由钟乳石(精焙)、蛇床子、远志、鹿茸(细研如磨末)、肉苁蓉、薯蓣、续断(为末)组成。药材由甘肃中医药大学附属医院中药房提供，分别制备成质量分数为 8，16，32 g/kg 的温肾强身散药物提取液。戊酸雌二醇片，拜耳医药保健有限公司广州分公司产品，批号156A；青霉素，华北制药股份有限公司，批号F6042103。水合氯醛，天津市光复精细化工研究所产品，批号20150105； Rat OPG ELISA Kit检测试剂盒(批号E20151102B)、Rat RANK/RANKL ELISA Kit检测试剂盒(批号E20151102B)、Rat trACP ELISA Kit检测试剂盒(批号E20151102B)、Rat BGP ELISA Kit检测试剂盒(批号E20151201A)，均为上海源叶生物科技有限公司产品。iMark型自动酶标分析仪，美国Bio-Rad公司产品；FA2004N型电子天平，上海精密科学仪器有限公司产品；ZY12306型微量加样器，德国艾本德产品；T6新悦-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品；TDZ5-WS型医用离心机，湖南平凡科技有限公司产品；双能X骨密度仪，美国GE公司产品；AG-IX生物力学万能实验机，日本岛津公司产品。

1.3 动物分组、模型的建立与给药

将60只大鼠随机分为假手术组，模型对照组，戊酸雌二醇组，温肾强身散高、中、低剂量组6组，每组10只。除假手术组外，其他各组参照文献[4-6]方法造模：以40 g/L水合氯醛(3 μg/g)腹腔注射麻醉大鼠；取俯卧位，备皮，消毒手术区皮肤；沿背部后正中线作1个1.0～1.5 cm的纵形切口，找到卵巢，沿子宫角处结扎并切除卵巢，逐层缝合伤口。假手术组大鼠只切除卵巢周围脂肪组织。术后给予青霉素抗感染，注意保温。造模成功后7 d给予药物干预，戊酸雌二醇组给予雌激素戊酸雌二醇片0.09 μg/g体质量灌胃，假手术组和模型对照组大鼠给予等体积蒸馏水灌胃，温肾强身散高、中、低剂量组依次给予8，16，32 g/kg温肾强身散溶液10 μL/g灌胃，每日1次，连续4周。

1.4 检测指标

1.4.1 动物一般状况

每天观察大鼠精神状态，毛发，活动，饮食饮水，大、小便等,并在末次给药24 h后记录各组大鼠体质量。

1.4.2 血清BGP、trACP、OPG、RANK、RANKL含量

末次给药后，腹主动脉采血，静置2～3 h，1 500 r/min离心10 min，分离血清。检测各组血清骨代谢相关生化指标(BPG、trACP)、OPG/RANK/RANKL调节系统指标(OPG、RANK、RANKL)含量，具体操作严格按试剂盒说明书进行。

1.4.3 骨密度

采血结束后，以100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉各组动物，四肢展开平置于双能X 线吸收测量仪平台上，通过计算机系统中小动物软件测定右股骨BMD。

1.4.4 断裂载荷和定伸长-位移

处死大鼠后取出完整股骨，将其右侧股骨送至兰州军区总医院，用AG-IX生物力学万能实验机检测断裂载荷和定伸长-位移。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠一般状态及体质量对比

与假手术组对比，模型对照组及各药物组大鼠皮毛欠光滑，其他一般状况如精神状态，活动，饮食饮水，大、小便情况均未见明显异常。与模型对照组对比，戊酸雌二醇组及温肾强身散3个剂量组大鼠精神状态，活动，饮食饮水，大、小便情况均无差异。与假手术组对比，模型对照组及各药物组大鼠体质量升高，差别有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组对比，温肾强身散3个剂量组和戊酸雌二醇组体质量降低，但差别无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠末次给药后体质量对比响

注：与假手术组对比，**P<0.05；与模型对照组对比，#P>0.05。

2.2 各组大鼠血清BGP、trACP含量对比

与假手术组对比，模型对照组大鼠血清BGP含量降低，trACP含量升高，差别有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比，温肾强身散中、高剂量组和戊酸雌二醇组血清BGP含量均升高，差别有统计学意义(P<0.05)；温肾强身散3个剂量组和戊酸雌二醇组血清trACP含量均降低，差别有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清BGP 、trACP 含量对比

注：与假手术组对比，**P<0.05；与模型对照组对比，##P<0.05。

2.3 各组OPG、RANK、RANKL含量对比

与假手术组对比，模型对照组大鼠血清OPG含量降低，RANKL和RANK含量均升高, 差别有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比，温肾强身散中、高剂量组和戊酸雌二醇组大鼠血清OPG含量升高，温肾强身散3个剂量组和戊酸雌二醇组大鼠血清RANKL和RANK含量均降低, 差别有统计学意义(P<0.05)。见表 3。

表3 各组OPG、RANK、RANKL含量对比

注：与假手术组对比，**P<0.05；与模型对照组对比，##P<0.05。

2.4 各组BMD对比

与假手术组对比，模型对照组大鼠BMD降低，差别有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比，温肾强身散各剂量组和戊酸雌二醇组BMD均升高，差别有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠BMD对比

注：与假手术组对比，**P<0.05；与模型对照组对比，##P<0.05。

2.5 各组断裂载荷、定伸长-位移参数对比

与假手术组对比，模型对照组大鼠股骨生物力学参数断裂载荷、定伸长-位移指标均明显下降(P<0.05)；温肾强身散各剂量组和戊酸雌二醇组可明显改善去卵巢大鼠断裂载荷、定伸长-位移参数(P<0.05)。见表5。

表5 各组大鼠断裂载荷、定伸长-位移参数对比

注：与假手术组对比，**P<0.05；与模型对照组对比，##P<0.05。

3 讨 论

绝经后骨质疏松症是由于绝经期妇女卵巢功能的退化造成机体雌激素水平下降而导致的一种骨代谢失衡病，属中医学“骨痿”“骨痹”等范畴。中医临床根据骨质疏松的病因病机，依据辨证论治将其分为肾阴虚、肾阳虚、脾胃虚弱、气虚血瘀等型，治法多以补肾、健脾、活血等为主，以补肾中药多用[7]。敦煌医方温肾强身散有温补肾阳、填精补髓的作用。方中以鹿茸为君药，可温肾阳，益精血，强筋骨；肉苁蓉温肾助阳，补益精血，与鹿茸配伍，不但能温补肾阳，又能填精补髓，此正如《难经》所谓“损其肾者，补其精”之意；蛇床子、钟乳石皆能温肾助阳，与鹿茸、肉苁蓉合用，加强温补肾阳之功；佐以远志交通心肾，宁心安神；薯芋既能培补后天、助气血阴阳化生，又能益肾涩精、防止肾精耗散，同时又培补后天，交通心肾；续断补肝肾，续筋骨，调血脉，可助薯芋气血化生之功。诸药合用，重在温补肾阳，兼能填精益髓。

有研究认为：骨吸收大于骨形成，骨代谢失衡是骨质疏松症发病的重要原因[8]。骨组织的骨量、结构、形状及内在的生物力学性能等指标是判定骨质疏松骨性能的重要指标[9]。BMD的测定是目前公认的诊断骨质疏松中骨量丢失的金标准[10]。在骨质疏松症的发展进程中，反映骨吸收与骨形成平衡状况的骨代谢生化指标会随之发生变化。BGP是骨形成的生化指标[11]。trACP反映骨吸收程度，是目前鉴别骨量丢失、诊断骨质疏松的可靠指标[12]。已有相关研究[13-15]证实：中药对调节骨代谢和骨量具有良好效果。本研究结果也显示：温肾强身散能够提高骨质疏松模型大鼠的BGP含量、BMD、断裂载荷和定伸长-位移。表明：温肾强身散对骨质疏松具有良好的治疗效果。

OPG/RANK/RANKL是一个能影响破骨细胞生成、分化、成熟和调节骨重建的枢轴旁分泌系统。近年研究[16-17]发现：OPG作为肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员，与其配体OPGL结合后，可阻止RANKL与OPGL的结合，使RANKL活化受阻，不能发挥破骨作用。李晶等[18]研究发现：淫羊藿总黄酮能促进去势大鼠骨组织OPG mRNA表达的表达，使RANKL活化受阻，有效抑制破骨细胞的分化和成熟，减少破骨细胞的增殖及骨吸收，从而对骨质疏松起到治疗的作用。本研究也证实：温肾强身散各剂量组能够有效降低骨质疏松大鼠血清RANK和RANKL的含量，中、高剂量组的温肾强身散能有效升高骨质疏松大鼠OPG的含量。说明：温肾强身散通过上调成骨细胞OPG 的表达、下调RANKL和RANK的表达来减少破骨细胞的生成、抑制破骨细胞的活化、降低破骨细胞的骨吸收功能来防治骨质疏松症。

综上所述，温肾强身散可能是通过OPG/RANK/RANKL调节轴实现对骨质疏松骨代谢的调控作用来达到治疗骨质疏松症的目的。

[1]于琼,吕思敏, 崔燎, 等.辅酶Q10对环磷酰胺大鼠股骨的显微结构和生物力学的影响[J].中国药理学通报,2015,31(3): 421-425.

[2]张宝红, 徐岩英, 董尔丹.2006-2013年国家自然科学基金资助骨质疏松研究的回顾性分析[J].中国骨质疏松杂志,2014,20(9): 1129-1132.

[3]赵亮, 刘静.治疗原发性骨质疏松症的单味中药研究进展[J].现代中西医结合杂志,2017,26(4): 451-454.

[4]巢传琦, 蔡君, 吕俊华, 等.补骨方对去卵巢大鼠骨质疏松的防治作用研究[J].中药材,2015,38(4): 807-809.

[5]王琳, 吴纪凯, 范淦彬, 等.补骨制剂Ⅱ对摘除卵巢大鼠骨质疏松的防治作用[J].中国老年学杂志,2015,35(6): 1633-1635.

[6]王权, 毛颖, 马春晖,等.鹿骨粉治疗大鼠卵巢摘除后所致的骨质疏松[J].中国妇幼保健,2015,30(17): 2861-2864.

[7]段卫华, 牛彦兵, 崔茗婉, 等.杜仲丸不同配比对去卵巢大鼠骨质疏松症的影响[J].中国实验方剂学杂志,2016,22(7): 130-133.

[8]郭世明, 张文明, 罗文娟, 等.青娥方对去卵巢大鼠骨组织FAK表达及骨代谢的影响[J].中华中医药杂志,2016,31(3): 991-994.

[9]李朵, 魏启幼.骨微结构与骨质疏松性骨折[J].中国骨质疏松杂志,2004,10(4): 519-522.

[10]巢传琦, 蔡君, 吕俊华.补骨方对去卵巢大鼠骨质疏松的防治作用研究[J].中药材,2015,38(4): 807-809.

[11]赵玉玺, 张彬, 湛梅圣, 等.金天格胶囊对骨质疏松性骨折大鼠BGP、trACP 表达的影响[J].中国骨质疏松杂志,2014,20(11): 1302-1305.

[12]赵丽丽, 秦文艳, 朱竟赫, 等.补土益水汤对去卵巢大鼠骨质疏松影响[J].辽宁中医药大学学报,2016,18(3): 20-22.

[13]解秀兰, 孙晓丽, 李丽娟, 等.壮骨伸筋胶囊对去势大鼠骨密度及骨代谢的影响[J].中国实验方剂学杂志,2016,22(14): 121-124.

[14]戴鹏, 邓鸣涛, 张立超, 等.杜仲叶对去势骨质疏松大鼠骨代谢的影响[J].中国骨质疏松杂志,2012,18(12): 1127-1130.

[15]吴青云, 熊雪婷, 许碧莲, 等.泼尼松对Ⅱ型胶原诱导性关节炎大鼠股骨微结构及生物力学的影响[J].中国药理学通报,2014,30(7): 1018-1022.

[16]冼华, 曹文富.补骨防疏汤对骨质疏松症大鼠骨组织OPG表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(2): 180-183.

[17]KLEJNA K, NAUMNIK B, GASOWSKA K, et a1.OPG/RANK/RANKL signaling system and its significance in nephrology[J].Folia Histochem Cytobiol,2009,47(2): 199-206.

[18]李晶, 宋敏, 罗晓, 等.淫羊藿总黄酮对去势大鼠骨组织BMP-2和OPG mRNA表达的影响[J].中华中医药杂志,2015,30(7): 2529-2531.

1001-6910(2017)09-0061-04

R681.1

:B

2017-06-29；

2017-08-03

(编辑 陶 珠)

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.09.26

颜春鲁，副教授， yanchl1979@126.com

甘肃省高等学校科研项目(2015A-097)；甘肃中医药大学教学研究与教学改革项目(ZH-201606)；甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究重大实验室开放基金(FZYK15-16-7)