UPLC—MS/MS法测定虾肉中氯霉素残留量的不确定度分析

李 涛

周艳华2

杨 滔1

孙桂芳1

(1. 湖南省食品质量监督检验研究院，湖南 长沙 410111；2. 长沙环境保护职业技术学院，湖南 长沙 410004)

UPLC—MS/MS法测定虾肉中氯霉素残留量的不确定度分析

李 涛1

周艳华2

杨 滔1

孙桂芳1

(1. 湖南省食品质量监督检验研究院，湖南 长沙 410111；2. 长沙环境保护职业技术学院，湖南 长沙 410004)

采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC—MS/MS)法测定Fapas能力验证项目虾肉中氯霉素的残留量，并进行不确定度评定，给出了不确定度。先建立了测定虾肉中氯霉素残留量的不确定度的数学模型，再对不确定度来源进行分析。通过对不确定度分量进行量化和合成，得出当虾肉中氯霉素残留量为0.820 8 μg/kg时，其扩展不确定度为0.146 2 μg/kg(k=2)，结果符合Fapas能力验证指定范围。评定结果表明，UPLC—MS/MS法测定虾肉中氯霉素试验过程中，样品称量、样品提取、校准曲线的配制、质谱测定、校准曲线的拟合等过程都会引入不确定度，其中，标准系列溶液配制和标准曲线的拟合引入的不确定度最大。

超高效液相色谱-串联质谱(UPLC—MS/MS)；虾；氯霉素；不确定度；Fapas

测量不确定度简称不确定度，是根据所用到的信息，表征赋予被测量值分散性的非负参数[1]。不确定度大小反应测量水平的高低，直接影响到产品合格判定。不确定分析对于质量控制具有重要意义，GB/T 27025—2008/ISO/IEC 17025:2005明确了检测和校准实验室应具有应用评定测量不确定的程序。

氯霉素是一类广谱抗生素，曾在中国畜牧水产业中被广泛应用[2-3]，但其对人类有很大的毒副作用，可抑制人类骨髓造血功能，引起再生性障碍贫血和其他血液病等[4]。中国已于2002年禁止使用氯霉素，并要求所有动物可食组织中不得检出氯霉素[5]。但少量不法分子为降低成本，仍少量使用效价高、价格低廉的氯霉素。氯霉素检测方法有液质法[6-8]、气相色谱法[9]、气质法[10]、电化学法[11]、传感器法[12-13]和胶体金法[14]等。超高效液相色谱-串联质谱(UPLC—MS/MS)是氯霉素检测使用最广泛的方法，其具有灵敏度高、选择性强等特点，氯霉素检出限为0.1 μg/kg，为确保检出结果的可信度，必须进行不确定度的评定[15-16]。

英国Fapas能力验证是专门用于食品检测分析方面的能力评估体系，通过实验室间测试结果的比对来判定实验室能力的合格评定活动。本试验采用UPLC—MS/MS法测定Fapas能力验证项目虾肉中氯霉素残留量，依据JF 1059.1—2012和JJF 1135—2005评定整个试验过程的不确定度，为检验数据上报提供提供科学、准确的依据，确保检出结果的可信度。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯霉素(纯度为98.6%)、氘代氯霉素(纯度为 98.0%)：德国Dr.Ehrenstorfer公司；

甲醇、乙腈、乙酸铵：色谱纯；

虾肉和虾肉空白基质：FAPAS 中国代理处。

1.2 仪器与设备

超高压液相色谱仪：LC-30型，日本岛津公司；

串联质谱仪：API 5500型，美国 AB Sciex 公司；

电子分析天平：BS224S型，德国赛多利斯公司；

台式冷冻离心机：X1R型，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

漩涡振荡器：HMS-350型，上海珂淮仪器有限公司；

氮吹仪：MV-5型，北京莱伯泰科股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 前处理方法 准确称取约2.0 g样品(精确至0.1 mg)于50 mL离心管中，加入乙腈10 mL，10 ng 氘代氯霉素，振摇10 min后6 000 r/min离心10 min，取上清液，加入乙腈10 mL提取第2次，合并2次上清液，转移至氮吹管，45 ℃氮吹干，超纯水定容至1.0 mL，过0.22 μm滤膜后，进行UPLC—MS/MS 测定。

1.3.2 UPLC—MS/MS测定色谱条件 色谱柱：Hypersil Gold C18液相色谱柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)；流动相：A相为水，B相为乙腈，C相为10 mmol/L乙酸铵，按表1进行梯度洗脱。

表1 流动相梯度洗脱表

1.3.3 UPLC—MS/MS测定质谱条件 离子源：电喷雾离子化(ESI)负离子模式；气帘气： 172.3 kPa，鞘气275.8 kPa，辅助气275.8 kPa，碰撞气中等，离子化电压-4 500 V，雾化温度550 ℃；多反应监测扫描(MRM)采集参数见表 2。

1.3.4 数学模型的建立 氯霉素残留量按式(1)计算：

X=C×V/m，

(1)

式中：

X——样品中待测组分残留量，μg/kg；

C——待测组分校准工作液的浓度，ng/mL；

V——样品溶液最终定容体积，mL；

表2 液质采集参数表

M——样品称样量，g。

2 结果与分析

2.1 试验结果

2.1.1 校准曲线的测定 测得校准曲线方程为y=0.201 62x+0.008 63，相关系数r=0.999 9。

2.1.2 样品重复性试验 平行处理6份供试样，结果分别为0.831 3，0.826 7，0.816 8，0.808 9，0.800 9，0.840 3 μg/kg，平均值为0.820 8 μg/kg，标准偏差为0.017 9 μg/kg。

2.1.3 样品回收率试验 取约2 g虾肉空白基质2份，添加与样品浓度相当氯霉素标准溶液，同试样处理方法，进行UPLC—MS/MS测定，得到虾肉中氯霉素的回收率分别98.2%和99.1%。

2.2 不确定度来源分析

根据前处理及测定，对样品中氯霉素残留量测定结果有影响的各种不确定的分量来源进行分析，不确定度因素引入见图1。由图1可知，样品称量、样品溶液制备定容、标准系列溶液配制、测量重复性、回收率都会给检验结果引入不确定度。

图1 氯霉素测定不确定度来源图

2.3 不确定度分析与评定

2.3.3 待测组分浓度不确定度urel(C)urel(C)的不确定度包括校准溶液配制和校准曲线拟合不确定度。校准曲线配制引入的不确定度有校准物质纯度、储备液配制、校准溶液的配制和温度变化；校准曲线拟合引入不确定包括校准溶液浓度、仪器波动和温度变化。

(1) 校准储备液配制引入的不确定度urel(C1)。

(4) 校准曲线拟合引入的不确定度urel(C4)：校准系列溶液进行UPLC—MS/MS测定，通过Excel拟合为校准曲线，校准曲线为y=0.201 62x+0.008 63，校准曲线拟合不确定度计算程序仅与响应值有关，与校准溶液的不确定度无关[17]。氯霉素校准曲线测定结果见表4。

校准曲线拟合引入不确定度：

(2)

(3)

urel(C4)=u(C4)/c0=0.065 5/0.82=0.079 9，

(4)

式中:

sA——校准曲线的校准差；

p——样品溶液的测定次数，p= 6；

N——校准溶液(含空白溶液) 的测定次数，N= 6；

b——校准曲线的斜率；

a——校准曲线的截距；

c0——由校准曲线方程求得的样品溶液中待测物的浓度，μg/L；

表3 校准系列溶液稀释步骤引入的不确定度

表4 氯霉素校准溶液测定结果†

†p=5，N=6，c均=5.0 μg/mL，c0=0.82 μg/L，b=0.201 62。

c均——各校准溶液浓度配制值的平均值，μg/L；

ci——各校准校准溶液的浓度点的配制值；

cj——由校准曲线方程得出的校准溶液的测定值，μg/L。

2.3.6 合成的相对不确定度 相对不确定度分量见表5，将各相对不确定分量进行合成。

表5 相对不确定度分量汇总表

2.3.7 扩展不确定度及结果表述 依据JJF 1135—2005，对于大多数测量采用包含因子k=2，则UPLC—MS/MS法测定虾肉中氯霉素残留量的扩展不确定度U=2×urel(X)=2×0.073 1=0.146 2，结果表述为虾肉中氯霉素残留量为(0.820 8±0.146 2) μg/kg，k=2。

3 结论

本次试验虾肉中氯霉素残留量测定为2016年11月Fapas国际能力比对项目，共110家单位参加，氯霉素残留量指定值0.857 μg/kg，检验结果氯霉素残留量0.821 μg/kg，CCβ为0.1，z-score为-0.2，表明本次试验结果数据可靠。

UPLC—MS/MS法测定虾肉中氯霉素试验过程中，样品称量、样品提取、校准曲线的配制、质谱测定、校准曲线的拟合等过程都会引入不确定度。本试验通过对试验过程中的玻璃器皿、温度变化、溶液稀释配制、重复测定、回收率等因素带来的不确定度进行评定，由于样品中氯霉素残留量低，标准品需经过多次稀释，标准系列溶液配制和标准曲线的拟合引入的不确定度最大。前处理过程及标准溶液中添加了内标物质，重复率和回收率的结果均比较好，引入的不确定度较小。UPLC—MS/MS灵敏度高，选择性强，但测试稳定性不强，因此测试过程会带来较大的不确定度。在试验操作过程中，严格规范操作，提高操作熟练度，增加混合标准系列溶液的测定次数，保持仪器的灵敏度，可保证结果的准确性。

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Uncertainty analysis of determination of chloramphenicol residue in shrimp by UPLC-MS/MS method

LITao1

ZHOUYan-hua2

YANGTao1

SUNGui-fang1

(1.HunanProvincialFoodQualitySupervisionandInspectionInstitute,Changsha,Hunan410011,China; 2.ChangshaEnvironmentalProtectionVoctionalCollege,Changsha,Hunan410004,China)

In this paper, the Fapas ability was used to verify the chloramphenicol residues in shrimp meat by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS), and the uncertainty was evaluated. Uncertainty was given. First, a mathematical model for determining the uncertainty of chloramphenicol residues in shrimp was established, and then the source of uncertainty was analyzed. The uncertainty of the uncertainty was 0.146 2 μg/kg (k= 2) when the chloramphenicol residues in the shrimp were 0.820 8 μg/ kg, and the results were in accordance with the Fapas ability test. Specify the scope. The results showed that the UPLC-MS / MS method was used to determine the uncertainty of the process of determination of chloramphenicol in shrimp，sample weighing, sample extraction, calibration curve, mass spectrometry and calibration curve etc were the major infact for uncertainty. The standard series solution formulation and the fitting of the standard curve were introduced with the greatest uncertainty.

ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); prawn; chloramphenicol; uncertainty; Fapas

湖南省自然科学基金项目(编号：2017JJ5062)

李涛，男，湖南省食品质量监督检验研究院助理研究员，硕士。

周艳华(1982—)，女，长沙环境保护职业技术学院工程师，硕士。E-mail: boylitao@163.com

2017—05—27

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.013