中国广西人群miRNA-17-92基因簇启动子区rs1491034和rs982873遗传多态性研究

黄华佗， 陆玉兰， 王 荣， 向 阳， 李北林， 韦叶生

中国广西人群miRNA-17-92基因簇启动子区rs1491034和rs982873遗传多态性研究

黄华佗， 陆玉兰， 王 荣， 向 阳， 李北林， 韦叶生

目的研究rs1491034和rs982873单核苷酸多态性(SNPs)在广西人群中的分布特点，比较二者基因型和等位基因在不同种族、地区人群间的分布差别。方法采用SNaPshot SNP分型技术和DNA测序法检测397例广西人群rs1491034和rs982873 SNPs，比较两位点基因型和等位基因频率与国际人类基因组单体型图(HapMap)计划公布的不同种族和地区人群间的差别。结果广西人群rs1491034和rs982873均存在TT，CT及CC 3种基因型。2个位点的基因型和等位基因频率在广西人群不同性别间比较，差别均无统计学意义(P>0.05)。广西人群rs1491034基因型和等位基因频率与HapMap-CEU和HapMap-YRI人群比较，差别均有统计学意义(P<0.01)，而rs982873基因型和等位基因频率与HapMap-JPT和HapMap-YRI人群比较，差别均有统计学意义(P<0.05)，但两位点基因型和等位基因频率与其他人群比较，差别均无统计学意义(P>0.05)。结论广西人群存在rs1491034和rs982873多态性，与其他种族、地区人群比较存在不同程度的差别。

多基因族； 启动区(遗传学)； 多态现象, 遗传； 大陆人口群

微小RNA(microRNA, miRNA)是基因调控领域的又一重大发现，通过与靶基因mRNA的3′非翻译区结合，导致mRNA发生降解或翻译抑制，从而在翻译水平调控靶基因的表达[1-2]。miRNA有成簇的聚集在染色体上的特点，通过一个共同的启动子转录生成多顺反子。在基因簇的研究方面，目前研究得较为深入的是微小RNA-17-92(microRNA-17-92, miRNA-17-92)基因簇。miRNA-17-92基因簇参与大量靶基因翻译的调控，参与正常人肺和心脏发育以及血管新生[3]。然而，在某些病理情况下，miRNA-17-92基因簇可促进肿瘤、免疫性疾病和心脑血管疾病等的发生和发展[4-6]。miRNA-17-92基因簇位于13号染色体长臂(13q31.3)miRNA-17-92基因簇的宿主基因(miRNA-17-92 cluster hostgene, MIR17HG)内，可编码生成6种成熟的miRNA(miRNA-17，miRNA-18a，miRNA-19a，miRNA-20a，miRNA-19b-1及miRNA-92a-1)。研究表明，miRNA基因启动子区多态性可影响miRNA的转录以及miRNA基因相关疾病的遗传易感性，从而导致miRNA相关疾病的发生和发展[7-9]。

随着人类基因组计划的完成，基因多态性的研究更多地趋向于局部的、多民族和多地区的分散研究。广西正常人群miRNA-17-92基因簇启动子区遗传多态性的研究可为后期miRNA-17-92基因簇相关疾病遗传多态性研究和群体遗传学研究提供参考资料。笔者采用SNaPshot SNP分型技术和DNA测序法检测miRNA-17-92基因簇启动子区rs1491034和rs982873遗传多态性，并将所得分型数据与国际人类基因组单体型图计划公布的HapMap-CEU、HapMap-HCB、HapMap-JPT和HapMap-YRI人群结果比较，分析不同种族、地区人群间两位点的遗传差别。

1 对象与方法

1.1 对象 收集右江民族医学院附属医院体检中心健康体检者397例，男性237例，女性160例，年龄(61.33±9.91)岁(27～83岁)，通过各项血液和影像学检查，未发现肿瘤以及肝脏、肾脏、心脑血管和神经系统疾病，排除遗传病家族史。本研究对象均为相互间无血缘关系的广西地区人群。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 用EDTA-K2抗凝的血常规管采集研究对象静脉血3 mL，置于-50 ℃冰箱保存备用。基因组DNA提取采用试剂盒离心柱法(TIANamp Blood DNA Kit)，提取后的DNA标本放在-50 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 引物设计与合成 查询NCBI SNP数据库，分别选取包含rs1491034和rs982873位点的适宜长度DNA片段，用网页引物设计软件Primer 3.0设计PCR引物，交由上海天昊生物科技有限公司合成。引物序列：

rs1491034：

上游：TGGGGTTTCTTCAGGGGATAATTG

下游：TGTTCTGAGTGGAGGGCCCTTAT

延伸引物：TAATCCTGAAATTCCCCCAATTA

rs982873：

上游：CCTTGTCCGGCAATCATGAAGT

下游：CAACATTCCCAAAGTCCGTGACA

延伸引物：TTTTTTGAAACACAAATTCTCCTTGA ATTTC

1.2.3 PCR扩增及测序 PCR扩增反应体系(20 μL)包含1×GC-I buffer(Takara)，3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L dNTP，1 U HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc.)，1 μL样本DNA和1 μL多重PCR引物，不足的体积用灭菌双蒸水补充。PCR产物用5U SAP酶和2U Exonuclease I酶纯化后用SNaPshot Multiplex Kit(ABI)进行延伸反应，延伸产物加入1U SAP酶纯化后上ABI3730XL测序仪测序，测序原始数据用GeneMapper 4.1 (AppliedBiosystems Co Ltd，USA)分析。

1.3 统计学处理 基因型和等位基因的频率用直接计数法计算。基因型和等位基因数据为计数型资料，不同组间基因型和等位基因频率比较分别用行×列表卡方检验(χ2)和四格表χ2检验计算。采用SPSS17.0软件处理数据。P<0.05为差别具有统计学意义。

2 结 果

2.1 miRNA-17-92基因簇启动子区rs1491034和rs982873分型 测序结果表明，rs1491034位点包含TT,TC和CC 3种基因型，其频率分别为25.2%，52.6%和22.2%；T和C等位基因频率分别为51.5%和48.5%。rs982873位点包含TT，TC和CC 3种基因型，其频率分别为37.5%，48.1%和14.4%，T和C等位基因频率分别为61.6%和38.4%。基因测序进一步证实结果(图1，2)。

A～C：箭头指向分别表示TT，TC及CC基因型.图1 miRNA-17-92基因簇启动子区rs1491034测序图Fig 1 Sequencing map for rs1491034 in the promoter of miRNA-17-92 cluster

A～C：箭头指向分别表示TT，TC及CC基因型.图2 miRNA-17-92基因簇启动子区rs982873测序图Fig 2 Sequencing map for rs982873 in the promoter of miRNA-17-92 cluster

2.2 广西人群miRNA-17-92基因簇启动子区rs1491034和rs982873遗传多态性在不同性别间的比较 经χ2验证，miRNA-17-92基因簇启动子区rs1491034和rs982873基因型数据均符合哈迪-温伯格遗传平衡定律(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)(P=0.28；P=0.74)，表明本研究所选的对象具有群体代表性。rs1491034和rs982873基因型和等位基因频率在不同性别间比较，差别无统计学意义(表1，P>0.05)。

表1中国广西人群miRNA-17-92基因簇启动子区rs1491034和rs982873基因型和等位基因频率在不同性别间的比较

Tab1Comparison of the genotype and allele frequency of rs1491034 and rs982873 polymorphisms in the promoter of miRNA-17-92 cluster between genders

SNPs性别nn基因型(%)TTTCCCn等位基因(%)TCrs1491034男性23755(23．2)127(53．6)55(23．2)237(50．0)237(50．0)女性16045(28．1)82(51．3)33(22．2)172(53．7)148(46．3)rs982873男性23791(38．4)110(46．4)36(15．2)292(61．6)182(38．4)女性16058(36．3)81(50．6)21(13．1)197(61．6)123(38．4)

SNPs：单核苷酸多态性.

2.3 中国广西人群miRNA-17-92基因簇启动子区rs1491034和rs982873基因型和等位基因频率与其他种族、地区人群比较 广西人群rs1491034基因型和等位基因频率与HapMap-CEU和HapMap-YRI人群比较，差别均有统计学意义(P<0.01)，但与HapMap-HCB和HapMap-JPT人群比较，差别均无统计学意义(P>0.05，表2，3)。广西人群rs982873基因型和等位基因频率与HapMap-JPT和HapMap-YRI人群比较，差别均有统计学意义(P<0.05)，但与HapMap-HCB人群比较，差别均无统计学意义(P>0.05，表2，3)。

表2中国广西人群miRNA-17-92基因簇启动子区rs1491034和rs982873基因型频率与其他种族、地区人群比较

Tab2The comparison between genotype frequency of rs1491034 and rs982873 polymorphisms in the promoter of the miRNA-17-92 cluster in Guangxi Chinese population and different other races, districts population

SNPs人 群nn基因型(%)TTTCCCHWEχ2Prs1491034广西人群397100(25．2)209(52．6)88(22．2)0．28--HapMap⁃HCB9022(24．4)46(51．1)22(24．4)0．830．220．90HapMap⁃JPT8828(31．8)48(54．5)12(13．6)0．233．790．15HapMap⁃CEU12086(71．7)34(28．3)-0．0793．52<0．01HapMap⁃YRI12078(65．0)40(33．3)2(1．7)0．2271．80<0．01rs982873广西人群397149(37．5)191(48．1)57(14．4)0．74--HapMap⁃HCB9026(28．9)48(53．3)16(17．8)0．452．510．29HapMap⁃JPT8820(22．7)42(47．7)26(29．5)0．7014．240．01HapMap⁃YRI1206(5．0)24(20．0)90(75．0)0．02169．22<0．01

SNPs：单核苷酸多态性； HWE： 哈迪-温伯格定律； HCB： 中国北京汉族人群； JPT： 日本东京人群； CEU： 具有北欧和西欧血统的犹他州人群； YRI：在非洲尼日利亚伊巴丹的约鲁巴人.

3 讨 论

miRNA存在pri-miRNA、前体miRNA(precursor miRNA, pre-miRNA)和成熟miRNA 3种类型，通过不完全互补配对的方式结合到目的mRNA的3′非翻译区，导致靶基因的mRNA发生降解或翻译抑制，调控众多基因的表达[1,10]。研究表明，一种miRNA可调控多达数百个目的基因mRNA的表达，而一个mRNA的表达也可由多种miRNA共同调节，虽然目前发现的miRNA只有几百个，但miRNA却调节着超过1/3的生物基因[2]。miRNA-17-92基因簇是目前研究得最多也是研究得最深入的miRNA基因簇之一，与生物正常生长发育以及肿瘤、免疫性疾病、心脑血管疾病和神经退行性病变等疾病的发生均有着密切联系，已成为当前研究的热点[3-4,11-12]。

表3中国广西人群miRNA-17-92基因簇启动子区rs1491034和rs982873等位基因频率与其他种族、地区人群的比较

Tab3The comparison between allele frequency of rs1491034 and rs982873 polymorphisms in the promoter of the miRNA-17-92 cluster in Guangxi Chinese population and different other races, districts population

SNPs人 群nn等位基因(%)TCχ2Prs1491034广西人群794409(51．5)385(48．5)--HapMap⁃HCB18090(50．0)90(50．0)0．130．71HapMap⁃JPT176104(59．1)72(40．9)3．320．07HapMap⁃CEU240206(85．8)34(14．2)90．08<0．01HapMap⁃YRI24067(29．6)318(70．4)69．04<0．01rs982873广西人群794489(61．6)305(38．4)--HapMap⁃HCB180100(55．6)80(44．4)2．230．14HapMap⁃JPT17682(46．6)94(53．4)13．38<0．01HapMap⁃YRI24036(15．0)204(85．0)160．03<0．01

SNPs：单核苷酸多态性；HWE：哈迪-温伯格定律；HCB：中国北京汉族人群；JPT：日本东京人群；CEU：具有北欧和西欧血统的犹他州人群；YRI：在非洲尼日利亚伊巴丹的约鲁巴人.

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)指在基因组的水平上由于单个核苷酸突变引起的DNA序列多态性，为人类可遗传变异中最常见的一种。SNPs的研究在解释不同群体、个体对疾病特别是对复杂疾病的易感性和对各种药物的耐受性以及对环境因子反应的表型差别方面起着很大的作用。人类基因组计划扫描发现，miRNA-17-92基因簇启动子区存在功能性SNPs位点，这些位点的SNPs改变可能会影响miRNA-17-92基因簇的表达，从而影响miRNA-17-92基因簇调控的靶基因相关疾病的发生和发展。

本研究结果表明，广西人群rs1491034和rs982873基因型和等位基因频率在不同性别间比较,差别均无统计学意义(P>0.05)，表明广西人群rs1491034和rs982873 SNPs无性别间差别。进一步将rs1491034和rs982873分型结果与国际人类基因组单体型图计划公布的4个人群数据比较发现，rs1491034基因型和等位基因频率与HapMap-CEU 和HapMap-YRI人群比较，差别均有统计学意义(P<0.01)，然而与HapMap-HCB及HapMap-JPT人群比较，差别均无统计学意义(P>0.05)。而rs982873基因型和等位基因频率与HapMap-JPT和HapMap-YRI人群比较，差别均有统计学意义(P<0.05)，但与HapMap-HCB人群比较，差别无统计学意义(P>0.05)。HapMap-CEU 和HapMap-YRI人群与广西人群属于不同种族，地缘关系远，且饮食和生活习惯上存在较大差别，因此与广西人群比较遗传差别大。而HapMap-HCB和HapMap-JPT人群与广西人群同属亚洲人，地理位置和亲缘关系近，因此与广西人群比较遗传差别相对较小。广西人群rs1491034T等位基因频率为51.5%，与同是亚洲人的HapMap-HCB(50.0%)和HapMap-JPT(59.1%)人群T等位基因频率相近，而与HapMap-CEU(85.8%)和HapMap-YRI(81.7%)人群的T等位基因频率相差较远。类似的，广西人群rs982873T等位基因频率为61.6%，与同是亚洲人的HapMap-HCB(55.6%)和HapMap-JPT(46.6%)人群T等位基因频率相近，而与HapMap-YRI(15.0%)人群T等位基因频率相差较远。以上结果均与“亲缘关系越近，基因型的分布差别越小”的遗传定律相吻合。基因多态有不同民族、种族和地区间的差别，虽然广西人群与HapMap-HCB及HapMap-JPT人群同属于亚洲人，但由于各地方的地理位置、环境和气候有所不同，饮食和生活习惯上也有较大差别，因此三者的基因型和等位基因比较也表现出一定差别，甚至出现广西人群rs982873位点基因型和等位基因频率与HapMap-JPT人群比较出现较大差别的结果。

随着人类基因组计划的完成，基因多态性的研究更多地趋向于局部的、多民族和多地区的分散研究。基因多态性研究的展开在解释不同群体、个体对疾病特别是对复杂疾病的易感性和对各种药物的耐受性以及对环境因子反应的表型差别方面都起着很大的作用。本研究发现，广西人群存在miRNA-17-92基因簇启动子区rs1491034和rs982873遗传多态性，其基因型和等位基因频率与不同种族、地区人群比较存在不同程度的差别。广西人群miRNA-17-92基因簇启动子区rs1491034和rs982873遗传多态性的研究可为群体遗传学和miRNA-17-92基因簇相关疾病的研究提供参考资料，同时可为广西地区建立区域基因数据库贡献一份力量。

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(编辑:张慧茹)

Exploration of Genetic Polymorphism of rs1491034 and rs982873 in the Promoter of miRNA-17-92 Cluster in China Guangxi Population

HUANG Huatuo, LU Yulan, WANG Rong, XIANG Yang, LI Beilin, WEI Yesheng

Department of Laboratory Medicine, Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities, Baise533000, China

Objective To explore the distribution characteristics of the rs1491034 and rs982873 single nucleotide polymorphisms (SNPs) in Guangxi populations, and to compare their genotype and allele frequency with different races and populations of other regions. Methods The SNPs of rs1491034 and rs982873 were detected by SNaPshot SNP and DNA sequencing methods. We statistically analyzed the difference between the genotype and allele frequency of the two SNPs that we studied and compared it with the data of different races and regional populations, while were published in the international HapMap project. Results The rs1491034 and rs982873 SNPs contain TT, TC and CC genotypes, respectively, in the Guangxi population. The genotype and allele distribution of the two SNPs were not significantly different between genders in the Guangxi population (P>0.05). The genotype and allele distribution of the rs1491034 SNP were significantly different from HapMap-CEU and HapMap-YRI populations (P<0.01), and the genotype and allele distribution of the rs982873 SNP were significantly different from HapMap-JPT and HapMap-YRI populations (P<0.05). However, the genotype and allele distribution of the two SNPs were not significantly different compared with other listed population. Conclusion There are rs1491034 and rs982873 SNPs in the Guangxi population, and there are varying degree of differences in the genotype and allele distribution of the two polymorphism between the Guangxi populations and other published populations of races/regions.

multigene family； promoter regions (genetics)； polymorphism, genetic； continental population groups

2017-04-06

国家自然科学基金(81560552；81260234)；广西高校重点实验室开放课题(kfkt20160064);广西研究生教育创新计划项目(201601009)

右江民族医学院附属医院 检验科，百色 533000

黄华佗，男，医学检验技师，医学硕士

韦叶生.Email: yeshengwei22@163.com

R34； R394.3； R394.5

: A

: 1672-4194(2017)04-0212-05