不同规格商品丹参质量比较研究△

桑梦如，黄楚璇，吴啟南，樊修和，乐巍，吴达维，许一鸣

(南京中医药大学 药学院，江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏 南京 210023)

·中药工业·

不同规格商品丹参质量比较研究△

桑梦如，黄楚璇，吴啟南*，樊修和，乐巍，吴达维，许一鸣

(南京中医药大学 药学院，江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏 南京 210023)

目的：建立同时测定商品丹参中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A、二氢丹参酮I、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA含量的高效液相色谱方法，并对20批不同产地的商品丹参进行质量评价。方法：收集自浙江、山东、江苏、河北、河南、四川等不同产区栽培及野生丹参20批。采用Waters xBridgeTMC18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇(A)-0.03%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱；柱温25 ℃；检测波长280 nm。通过DPS统计软件进行聚类分析，对20批丹参有效成分含量进行综合评价。结果：上述9种有效成分在一定范围内具有较好的线性关系。精密度、重复性、稳定性的RSD值均小于3%，加样回收率为95.13%～101.35%。从产地看，河南、山东产丹参质量最优，四川丹参品质亦佳，河北、江苏、浙江产者次之。直接购自丹参药材产地者，有效成分含量高于购自药房者。结论：不同规格商品丹参9种有效成分的含量差异较大，其中山东、河南丹参中丹参酮类和丹酚酸成分含量较高。HPLC法同时测定丹参中9种有效成分含量，可更加全面地评价商品丹参的质量。

丹参；高效液相色谱法；多成分；含量测定；质量评价

丹参为唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根茎。气微，味微苦涩，具有活血祛瘀等功能[1]。现代药理研究证明，丹参具有抗氧化[2]、抗动脉粥样硬化[3-4]、抗肿瘤[5]、预防中风[6]、降低血糖[7]、延缓衰老[8]等作用，是目前治疗心血管疾病的首选中药，其临床治疗和用药安全与原药材品质密切相关。由于商品丹参种质资源复杂、分布广、采收加工各异，导致其质量差异大，因此，结合现代分析手段完善丹参的品质评价体系具有重要价值。

丹参的主要有效成分分为脂溶性成分和水溶性成分。脂溶性成分主要为丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮等邻醌型的丹参酮类二萜，此类化合物在丹参中含量较高，且具有较强的生理活性，能够改善血液循环、抗菌和抗炎，是丹参的有效组分之一[9]。丹参的水溶性成分主要包括丹参素、丹酚酸A～J、原儿茶醛等酚酸类化合物[10]，其具有抗氧化、抗凝血、抗血栓形成、调血脂和细胞保护作用[11]。基于此，《中华人民共和国药典》2000年版、2005年版、2010年版、2015年版一部，丹参项下的规定分别是：丹参酮ⅡA不低于0.20%，丹参酮ⅡA不低于0.20%、丹酚酸B不低于3.0%，丹参酮类(丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ)的总量不低于0.25%、丹酚酸B不低于3.0%[1，12-14]。该修订表明，多成分含量测定能有效地评价丹参的品质。因此，建立高效液相色谱法同时测定丹参脂溶性成分和水溶性成分含量具有十分重要的意义，将有利于更加全面地评价丹参的质量。

1 试药和仪器

1.1 试药

对照品：丹酚酸B(批号：YJ-141112)、丹酚酸A(批号：YJ-141204)、丹参素(批号：YJ-141018)、原儿茶醛(批号：YJ-140417)、原儿茶酸(批号：YJ-140320)、丹参酮IIA(批号：YJ-140703)、丹参酮I(批号：YJ-140318)、隐丹参酮(批号：YJ-140809)、二氢丹参酮I(批号：YJ-140810)(江苏永建医药科技有限公司，规格为20 mg，纯度为HPLC≥98%)。

试剂：甲醇(南京化学试剂有限公司，批号：14052811206，分析纯)；甲醇(江苏汉邦科技有限公司，批号：150415，色谱纯)；乙腈(德国Merck公司，色谱纯)；无水乙醇(无锡市亚盛化工有限公司，批号：20150120，分析纯)；磷酸(国药集团化学试剂有限公司，批号：T20100802)；超纯水自制。

药材和饮片：20批收集自浙江、山东、江苏、河北、河南、四川等不同产区栽培及野生丹参，均经南京中医药大学吴啟南教授鉴定，确认为唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根茎，见表1；丹参对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：0923-9403)。

表1 20批商品丹参信息表

1.2 仪器

DHG-9023A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；BT125型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；HH数显恒温水浴锅(江苏金坛市今城国胜实验仪器厂)；KH300SP型超声波提取设备(昆山禾创超声仪器有限公司)；SAGA-10TY型实验室级超纯水器(南京易普易达科技发展有限公司)；Waters 2695型高效液相色谱仪(高精度四元梯度泵，自动进样器)、Waters 2998 PDA检测器、Waters Empower 色谱工作站、Waters xBridgeTMC18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters xBridgeTMC18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：25 ℃；流动相：甲醇(A)-0.03%磷酸水溶液(B)；流速：1.0 mL·min-1；梯度洗脱：0～7 min：83%B～79%B，7～9 min：79%B～52%B，9～14 min：52%B～50%B，14～15 min：50%B～35%B，15～16 min：35%B～32%B，16～41 min：32%B～30%B，41～46 min：30%B～20%B，46～51 min：20%B～10%B，51～55 min：10%B；检测器：Waters 2998 PDA检测器；检测波长：280 nm；进样量：15 μL。

2.2 混合对照品溶液的制备

分别精密称取丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A、二氢丹参酮I、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA对照品适量，用甲醇配置成265.0、10.47、24.61、294.1、45.63、46.17、491.3、186.3、248.8 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取样品约0.2 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入24 mL 85%甲醇溶液，70 ℃超声提取85 min，滤过，浓缩，以甲醇定容至5 mL，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 标准曲线绘制

精密吸取上述混合对照品溶液1 mL于2 mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀。重复以上步骤，逐级稀释10次，再将各浓度溶液过0.22 μm微孔滤膜于进样小瓶中。按2.1色谱条件测定各混合对照溶液中上述9种对照品含量，分别求标准曲线，结果见表2。

表2 5种酚酸类和4种丹参酮类成分标准曲线的线性回归方程、相关系数和线性范围

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 精密吸取上述混合对照品溶液，按2.2项下方法，按2.1色谱条件连续进样6次，考察溶液中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A、二氢丹参酮I、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA含量，重复测定6次，并分别计算RSD值，结果见表3。

2.5.2 稳定性试验 取上述供试品溶液，按2.3供试品溶液项下方法，按2.1色谱条件分别于0、1、3、6、12、24 h测定样品中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A、二氢丹参酮I、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA含量，并计算RSD值，结果见表3。

2.5.3 重复性试验 取同批样品约0.2 g，共6份，精密称定，按2.3项下方法，平行制备供试品溶液6份，并按2.1色谱条件”测定样品中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A、二氢丹参酮I、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA含量，并计算RSD值，结果见表3。

2.5.4 加样回收率 精密称取已知含量样品0.2 g，共6份，按2.3供试品溶液的制备方法制得供试品溶液，分别加入样品中已知含量的80%、100%、120% 3个水平的对照品溶液，测定峰面积，计算回收率及RSD值。结果见表3。

表3 精密度、重复性、稳定性和加样回收率试验结果

2.6 样品测定

精密吸取上述混合对照品溶液，按2.2混合对照品溶液的制备方法制备成对照品溶液，按2.1

色谱条件进样，见图1。取20批样品粉末各约0.2 g，精密称定，按2.3供试品溶液的制备方法制备成供试液，按2.1色谱条件进样，用标准曲线法计算各批供试品中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A、丹参酮IIA、二氢丹参酮I、丹参酮I、隐丹参酮的含量，色谱图见图1，含量结果见表4。

注：A.混合对照品；B.供试品；1.丹参素；2.原儿茶酸；3.原儿茶醛；4.丹酚酸B；5.丹酚酸A；6.二氢丹参酮I；7.丹参酮I；8.隐丹参酮；9.丹参酮IIA。图1 丹参高效液相色谱图

表4 丹参中9种有效成分含量测定结果(n=3) %

表4表明，商品丹参样品1、9的丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA总量不符2015版《中华人民共和国药典》标准，分别为0.146%和0.193%，商品丹参样品3、4、14的丹酚酸B含量未达到2015版《中华人民共和国药典》标准，分别为1.847%、0.988%和1.307%。样品1虽为野生商品丹参，但贮存时间过久，部分有效成分含量明显降低；样品1、16～20为丹参药材，而样品2～15均为丹参饮片，丹参药材的有效成分含量相对较饮片高。结合药材性状可知，药材外皮较红，粉末也较红，所含丹参酮含量较高；药材外皮棕红，粉末棕黄色，所含丹酚酸含量较高。

根据丹酚酸类和丹参酮类有效成分含量，利用DPS统计软件对20批商品丹参样品进行聚类分析，结果见图2。20批丹参样品可聚为三类，第一类包括8份样品，此类样品所含丹酚酸类和丹参酮类有效成分较少；第二类包括6份样品，此类样品有效成分含量属中等；第三类包括6份样品，此类样品有效成分含量均较高。由丹酚酸类和丹参酮类的聚类树状图可知，以山东和河南产者为最优，四川丹参质量亦佳；江苏、浙江、河北所产丹参的丹参酮类和丹酚酸类成分含量相比之下较低，部分山东产丹参饮片有效成分含量也低，反映中药产地加工及饮片加工对中药品质产生影响。

图2 商品丹参丹酚酸类和丹参酮类有效成分含量的聚类树状图

3 分析讨论

3.1 提取条件的选择

在实验前期通过均匀设计法对丹参的提取工艺进行优化，考察了甲醇、乙醇两种溶剂浓度(50%～100%)、固液比(1∶120～1∶270)、提取时间(15～90 min)、提取温度(20～70 ℃)，回流和超声两种提取方式对提取效率的影响，从最佳的4个提取工艺方案中根据加权评分选择最优者，即120倍量85%甲醇溶液，70 ℃超声提取85 min。

3.2 结果分析

含量测定结果显示，外表较红的丹参商品丹参酮类成分含量较高，而粉末偏深棕的商品丹酚酸类成分含量较高。可见，传统鉴别手段可以一定程度的判断丹参商品的质量优劣。由本实验结果可知，产地采购药材的9种有效成分含量均高于饮片，原因可能一是丹参饮片的炮制加工造成有效成分的流失；二是包装储藏不当，在储藏过程中有效成分降低。因储藏受潮会导致丹参中水溶性成分的溶解，储存时间的延长会导致有效成分含量降低。张卓能等[15]发现，随着丹参药材储存时间的增加，其中的丹酚酸B和丹参酮ⅡA含量均呈下降趋势，储存时间为9个月时基本达到最小值。

从含量测定和聚类分析结果也可看出，市面上流通的丹参药材及饮片质量参差不齐。吕文海等[16]也在实验过程中发现，相当多市面上销售的丹参药材中丹参酮IIA含量不符合药典标准。潘英妮等[17]用高效液相色谱法考察30批国产丹参质量，以丹酚酸B含量为指标，6批样品达不到2005版《中华人民共和国药典》要求，占总样品数的20%；以丹参酮IIA含量为指标，20批样品达不到2005版《中华人民共和国药典》要求，占总样品数的67%。实验过程中发现，供试品溶液存放一段时间后(48 h以上)，丹酚酸B明显下降，丹参素含量增高，有文献报道丹酚酸B遇热可能发生酯水解或苯并呋喃开环，丹参素、原儿茶醛等含量升高[18-19]，故规范实验操作十分重要。

3.3 展望

丹参作为大宗药材，目前虽已形成商品规格，但其产区广泛、栽培年限与产地采收加工与炮制方法参差不齐，导致商品质量的差异很大，这将严重影响丹参临床用药的有效性和安全性。因此，制定好丹参药材全国适宜生产区划，开展丹参产地加工与饮片生产一体化研究，同时对其包装、贮藏运输适宜条件开展研究，确定丹参药材、饮片的有效期十分重要。

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QualityComparationofVariousCommercialProductsofSalviaeMiltiorrhizaeRadixetRhizoma

SANGMengru，HUANGChuxuan，WUQinan*，FANXiuhe，YUEWei，WUDawei，XUYiming

(Collegeofpharmacy，NanjingUniversityofChineseMedicine，CollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，NationalandLocalCollaborativeEngineeringCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrializationandFormulaeInnovativeMedicine，Nanjing210023，China)

Objective：The study is aimed to establish an HPLC method for simultaneous determination of tanshinol，protocatechuic acid，protocatechualdehyde，salvianolic acid B，salvianolic acid A，dihydrotanshinone I，tanshinone I，cryptotanshinone and tanshinone IIAin commercial products of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma (CPSMR)，and evaluate the qualities of 20 samples from different specifications of CPSMR.Methods：20 batches ofS.miltiorrhizawere collected from Zhejiang，Shandong，Jiangsu，Hebei，Henan，Sichuan and other habitats.The determination was performed on a Waters xBridgeTMC18column(250 mm×4.6 mm，5 μm)with a gradient mobile phase consisting of methanol(A)-0.03% phosphoric acid solution(B)at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The column temperature was 25 ℃ and the detection wavelength was 270 nm.Cluster analysis was conducted with DPS software for comprehensive quality evaluation of 20 batches of CPSMR.Results：All the 9 effective constituents showed good linearity.The RSD of the precision，repeatability and stability tests were less than 3%.The average recoveries were in the range of 95.13%-101.35%.In view of habitats，CPSMR from Sichuan province were better than those from Hebei，Jiangsu and Zhejiang province.CPSMR from Henan and Shandong have the samples purchased from pharmacies.Conclusion：The contents of 9 effective constituents are different among Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma of differet specifications in markets from various habitats.SMRR products from Shandong and Henan have higher contents of tanshinones and salvianolic acids.HPLC can be used for the simultaneous determination of 9 effective constituents in SMRR products，which could be applied for the comprehensive quality evaluation of SMRR products.

Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma；HPLC；multicomponent；content determination；quality evaluation

2016-03-31)

江苏省高校优势学科建设工程资助项目(2014)；国家公益性行业专项(201407002)；国家公共卫生行业专项(2014002)

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吴啟南，博士生导师，研究方向：中药资源生产与品质评价；Tel：(025)85811507，E-mail：qnwyjs@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.3.025