Micro-CT对急性肺结核小鼠模型动态演变的监测价值

王青乐， 张志勇， 施裕新， 朱召芹， 冯艳玲， 张兴伟， 冯 峰， 张昊凌， 曾蒙苏， 陈 刚*

1.复旦大学附属中山医院放射科，上海市影像医学研究所，复旦大学上海医学院影像医学系，上海 2000322.复旦大学附属公共卫生临床中心影像科，上海 2015083.南通市肿瘤医院影像科，南通 226361

·论著·

Micro-CT对急性肺结核小鼠模型动态演变的监测价值

王青乐1， 张志勇1， 施裕新2， 朱召芹2， 冯艳玲2， 张兴伟1， 冯 峰3， 张昊凌1， 曾蒙苏1， 陈 刚1*

1.复旦大学附属中山医院放射科，上海市影像医学研究所，复旦大学上海医学院影像医学系，上海 2000322.复旦大学附属公共卫生临床中心影像科，上海 2015083.南通市肿瘤医院影像科，南通 226361

目的： 探讨micro-CT对急性肺结核小鼠动态演变过程的监测价值。方法： 用滴鼻法建立急性感染C57BL/6J小鼠肺结核模型，设为实验组，同时设立对照组。两组分别在实验组滴鼻后第1、4、8、12周进行micro-CT扫描，并与病理学检查结果对比。结果： 实验组共40只小鼠，死亡9只，3只肺内阴性，余28只小鼠分为4个亚组(分别7、6、8、7只)。对照组4亚组，每组5只。实验组小鼠感染第1周，71.4%表现为磨玻璃密度影(GGO)，57.1%表现为支气管充气征，对应病理表现为肺泡腔渗出和肺泡间隔增宽；感染第4周，micro-CT主要表现为GGO和小灶性实变(66.7%)，对应病理表现为肺泡腔渗出和实变，可见类上皮细胞、多核巨细胞和泡沫细胞；感染第8周，结节、支气管充气征和实变3种表现比例相当，病理对应实变和结核小结；感染第12周，结节出现比例最高(57.1%)，对应病理表现为结核肉芽肿形成。结论： 急性小鼠肺结核模型的肺部micro-CT及病理动态演变基本一致，可用于模拟人类肺结核感染过程，评估疾病进程。

肺结核；动物模型；X线计算机体层摄影术；病理学

近年来，由于人口老龄化、空气污染加重、HIV感染率上升及多重耐药等因素的影响，全球范围内肺结核发病率不断上升，严重威胁人类健康[1-2]。肺结核的防治成为目前研究的热点。借助动物模型模拟肺结核在人体的感染历程是结核病研究的常用手段，但目前缺乏较好的动态监测手段[3-4]。因此，本研究采用micro-CT动态观察肺结核模型小鼠的病情进展，并与不同时期小鼠肺结核病理学结果进行对照，探讨其潜在的应用价值，为其临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物及仪器 SPF级C57BL/6J雌性小鼠60只(上海西普尔-必凯实验动物有限公司)，许可证号为SCXK(沪)2008-0016，8周龄，体质量18～22 g，SPF级。采用标准人型结核菌株H37Rv。Micro-CT (eXplore Locus)，购自加拿大GE Healthcare。

1.2 结核小鼠模型的制备 ABSL-3级实验室滴鼻法(H37Rv)感染40只小鼠，菌液浓度1×107CFU/mL[3-4]，每只小鼠滴鼻20 μL；随机分为4亚组，分别在感染后第1、4、8、12周后进行micro-CT扫描和病理分析。对照组小鼠20只饲养于SPF级动物房，不进行滴鼻感染,随机分为4亚组(n=5)，在实验组开始实验后的24 h内对其进行micro-CT扫描和病理分析。

1.3 Micro-CT扫描 将实验组小鼠麻醉完全后放置于扫描瓶内，经外表面消毒、紫外线照射15 min后传出ABSL-3级实验室，进行micro-CT扫描。Micro-CT扫描参数：管电压50 kV，管电流450 μAs，角增量0.7°，曝光时间300 ms，平均帧数为2帧；探测器组件模式4×4，扫描时间16 min，锥体束方法重建。二维电荷耦合探测器(CCD)单元大小为27 μm，有效像素94.0 μm，分辨率45.0 μm×45.0 μm×45.0 μm。图像后处理软件为GE Micro View[4]。

1.4 菌落计数及病理分析 将扫描完成后回ABSL-3级实验室的小鼠脱颈处死，取肺组织，肉眼观察标本，表面可见白色结节或颗粒样病灶。选取约1/3肺叶组织(尽量含肉眼可见病灶)，加入PBS Tween-80 1 mL，匀浆机最大转速匀浆180 s，离心后吸取上清100 μL，稀释为1 000倍的混悬液，吸取100 μL涂布到平板培养基，置于ABSL-3级实验室内37℃培养箱中，3周后计数菌落。约1/2肺叶组织-80℃冻存备用；余大部分肺叶组织分别做H-E染色及抗酸染色。对照组小鼠同样处理。

2 结 果

2.1 小鼠生存情况 40只感染小鼠中，共计死亡9只，肺内未出现阳性病灶者3只，剔除后，第1、4、8、12周各时间点实验小鼠数目分别为7、6、8、7只；对照组小鼠每组5只，无死亡。

2.2 结核杆菌培养结果 实验组可观察到浅黄色的菌落生长，而对照组未发现菌落生长。仅在感染12周时，2例结核杆菌为阴性，余均可见菌落生长。结核菌落计数结果见图1。

图1 小鼠感染结核菌肺组织荷菌量(log 10 CFU)变化

2.3 肺结核micro-CT表现 对照组小鼠在第1、4、8、12周micro-CT扫描肺内均未发现异常病灶(图2A)。实验组感染第1周，7只小鼠表现为边界模糊的磨玻璃密度影(ground glass opacity GGO,图2B)或实变。感染第4周，4只肺部可见GGO及斑片状实变影(图2C)，累及肺体积的50%，2例表现为多个孤立结节。感染第8周时，8只小鼠肺内病变范围增大，3例以多灶性或弥漫性实变为主，累及肺体积约80%(图2D)；3例表现为大小不等的多发结节伴有大小不等的实变灶；2例肺内无明显病灶，仅表现为胸膜增厚。感染第12周，3只小鼠表现为单侧或双侧肺弥漫实变(几乎累及全肺)，伴有支气管充气征，肺周未见受累(图2E)，伴散在小结节影，而余4例肺内以散在小结节影为主(图2F)，边较清晰，伴或不伴斑片样实变影。

实验组小鼠随感染时间延长其micro-CT表现如表1所示：感染第1周，71.4%小鼠表现为GGO，57.1%出现支气管充气征；感染第4周，66.7%表现为GGO和小灶性实变；感染第8周，结节样增殖性病变表现比例增高，且与其他征象出现比例相当；感染第12周，结节比例最高，约57.1%。

图2 对照组及实验组小鼠micro-CT表现

A:对照组小鼠感染第12周肺内未见异常；B:感染1周，小鼠肺结核micro-CT示右下肺(小鼠仰卧位，图左侧示小鼠右侧)显示边界不清的小斑片状GGO；C:感染4周，小鼠肺结核micro-CT示左上肺小斑片状实变，边界不清；D:感染8周，小鼠肺结核micro-CT示两肺多发团片样实变，可见支气管充气征，右侧叶间胸膜增厚；E:感染12周，1只小鼠两肺弥漫实变伴支气管充气征，几乎累及全肺；F:感染12周，另1只小鼠micro-CT扫描可见右肺内见多个结节(箭头)

表1 实验组各亚组小鼠micro-CT影像表现分析 n(%)

2.4 病理结果

2.4.1 大体病理解剖 感染1周时，小鼠肺组织肉眼观察未见明确病灶。感染4周时，小鼠肺组织表面见散在分布的小结节状、颗粒状灰白色病灶。感染8周时，可见多发结节连续呈斑片状。感染12周时肉眼见片状、结节状灰白色病灶(图3)，其中1例肺组织肿胀、体积增大，病灶不规则呈淡灰色，结核杆菌培养结果阳性；5例肉眼观未见明确病灶，但其中3例结核杆菌培养阳性。对照组各组小鼠肺肉眼均未见病灶。

图3 小鼠肺组织大体标本

2.4.2 H-E及抗酸染色 对照组小鼠仅进行H-E染色，均未发现病变(图4A)。急性感染初即感染第1周，H-E染色7只小鼠均可见肺泡间隔增宽，大量淋巴细胞浸润，中性粒细胞和巨噬细胞散在分布，3只并见类上皮细胞和泡沫细胞(图4B)。感染4周后，4只小鼠镜下见肺组织大量巨噬细胞和泡沫细胞，其中2只micro-CT表现为结节的小鼠在实变组织内见散在类上皮细胞形成，偶见多核巨细胞，并有结核小结形成趋势(图4C)。感染8周后，3只表现为多发斑片状实变，实变范围较感染4周时扩大，伴大量泡沫细胞和巨噬细胞浸润；另3只并见类上皮细胞和多核巨细胞增多，有结核小结形成趋势(图4D)。感染12周后，4只表现为弥漫实变，与感染8周时病理所见相同，实变内可见肉芽肿样病变形成，镜下见多核巨细胞或类上皮细胞周围多发淋巴细胞浸润，而micro-CT上的小结节对应为孤立结核结节，结节周围肺泡壁不厚(图4E、4F)。抗酸染色见病变区域、巨噬细胞内或肺泡腔内散在或成簇分布红色条状结核分枝杆菌(图5)。

图4 小鼠肺组织H-E染色结果

A～F示对照组及实验组小鼠肺组织病理表现，与图2A～2F基本对应. A:对照组正常小鼠肺组织；B:感染1周时，镜下显示肺泡间隔明显增宽；C:感染4周时，肺泡腔内充填渗出物，成斑片状实变；D:感染8周时，高倍镜下可见实变背景下肺泡腔内巨噬细胞形成；E,F:感染12周时，小鼠肉芽肿,低倍镜下见结核肉芽肿形成，周围为正常肺泡(E)，高倍镜下见上皮样肉芽肿由多个Langhans巨细胞聚集而成，周围有淋巴细胞和纤维母细胞浸润(F). Original magnification: ×100(A,B,C,E), ×400(D,F)

图5 小鼠肺组织抗酸染色结果

病灶内成簇聚集的多条红色条状结核杆菌. Original magnification: ×400

3 讨 论

动物模型的实验结果虽然不能直接应用于人，但可以提供假说和确切的实验数据。选用C57BL/6J小鼠作为感染对象，是因为小鼠体型小、种群数量庞大，易于维持生物安全三级实验室环境，且C57BL/6J小鼠是近交系小鼠中对结核分枝杆菌最敏感的动物[5-6]。

感染组小鼠荷菌量第1周即达(6.30±0.02)log 10 CFU，可能与滴鼻法大量的菌液直接入肺，对肺组织的物理损伤与结核感染互相促进，造成了严重急性肺感染。第4周和第8周菌量稳定，维持在同一水平，而不是随感染时间的延长呈对数上升趋势[7-9]。感染12周的结核杆菌培养结果亦低于其他研究[10]，荷菌量未维持在高水平平台期。这可能与感染过程中小鼠自身免疫力产生及实验操作有关。

对照micro-CT表现和H-E染色病理结果，可发现小鼠感染急性肺结核存在其演变规律。感染初期以GGO和小斑片影为主，对应病理改变为肺泡间隔增厚、中性粒细胞浸润，感染4周时micro-CT表现的局限性实变对应病理学肺泡塌陷，巨噬细胞聚集、类上皮细胞和泡沫细胞形成。感染8周与感染12周小鼠肺结核病灶开始出现两种转归。(1)感染加重：实变范围扩大，且随感染时间延长而加重；(2)修复：形成结核肉芽肿，或仅表现为胸膜增厚，后者与文献[11-12]报道相符，渗出病变会随疾病发展而消散。肉芽肿周围为正常的未塌陷肺泡，可能与细胞免疫控制了结核分枝杆菌增殖和疾病进展有关，也可能由于小鼠机体存在一定的修复能力，抵抗力较强[13]。

本研究成功建立了小鼠肺结核模型，并分析了随结核感染时间的延长在micro-CT上的动态演变及病理学改变。各时期的影像学及病理学表现较准确地反映了小鼠肺结核病理改变，可用于模拟人类感染肺结核过程。在进行结核动物模型的相关实验中，可适当应用micro-CT观察造模情况及实验进展，减少对小鼠的不必要处死；而在影像学靶向造影剂研究等对影像表现的把握则起到关键的作用。

本研究仍存在不足之处：(1)同批处理小鼠数目较多，在感染第12周处理时ABSL-3级实验室操作时间限制，未能及时涂板进行结核杆菌培养，而是在-80℃冻存后涂板，可能造成部分结核杆菌死亡，影响计数结果；(2)由于micro-CT扫描设备限制，扫描时间过长，同时结核感染小鼠扫描时须放在隔离瓶中，麻醉是否满意及呼吸运动等因素对图像质量造成的影响难以控制；(3)micro-CT分辨率较差，难以观察到人类结核高分辨率CT的诸多征象[14]。但是，随着CT技术的发展，新的micro-CT有望克服这些不足，在成像速度和成像清晰度方面都会有很大的提高。

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[本文编辑] 廖晓瑜， 贾泽军

The value of micro-CT in monitoring the dynamic evolution of acute pulmonary tuberculosis in mice

WANG Qing-le1, ZHANG Zhi-yong1, SHI Yu-xin2, ZHU Zhao-qin2, FENG Yan-ling2, ZHANG Xing-wei1, FENG Feng3, ZHANG Hao-ling1, ZENG Meng-su1, CHEN Gang1*

1. Department of Radiology, Zhongshan Hospital, Fudan University; Shanghai Institute of Image Medicine; Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China2. Department of Radiology, Fudan University Public Health Clinical Center, Shanghai 201508, China3. Department of Radiology, Nantong Tumor Hospital, Nantong 226361, Jiangsu, China

Objective： To study the value of micro-CT in monitoring the dynamic evolution of acute pulmonary tuberculosis in mice.Methods： Establish the murine tuberculosis model of C57BL/6J in intranasal as the experiment group. The control group was set at the SPF level. Micro-CT scans were undertaken 1, 4, 8, 12 weeks later， respectively. And then the mice were sacrificed and the lung tissue was taken for pathological analysis.Results： In the experiment group, nine mice died and three were negative. So, totally 28 mice were enrolled. There were 7,6,8,7 mice in each subgroup, respectively. One week after infection, ground glass opacity (GGO) was 71.4% and consolidation was 57.1% in the experiment group. Corresponding pathology showed alveolar exudate and alveolar septum widened. Four weeks after infection, the imaging findings included GGO and patchy opacities (in 66.7%) in the experiment group. Microscopically, alveolar effusion and consolidation, with epithelioid cells, multinucleated giant cells and foam cells were found. Eight weeks after infection, nodules, air bronchogram and consolidation had equal proportion in the experiment group. Microscopically, it showed consolidation and tuberculosis nodules. 12 weeks after infection, nodules had the highest proportion, about 57.1% in the experiment group. Microscopically, the nodules showed granulomas.Conclusions： The images of acute pulmonary tuberculosis murine model can reflect the pathological changes, which can be used to simulate the course of human pulmonary tuberculosis and evaluate the disease process.

pulmonary tuberculosis; animal models; X-ray computed tomography; pathology

R 521

A

2017-07-18 [接受日期] 2017-07-26

国家自然科学基金(81601634). Supported by National Natural Science Foundation of China(81601634).

王青乐，博士，住院医师. E-mail: wangql1986@163.com

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-64041990, E-mail: chen.gang@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170599