不同红茶中主要氨基酸含量及其对小鼠自主活动的影响研究

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(1.云南农业大学 普洱茶学教育部重点实验室,云南昆明 650201;2.云南省茶深加工工程技术研究中心,云南昆明 650201;3.云南农业大学 食品科学技术学院,云南昆明 650201;4.安康市林业局,陕西安康 725000;5.安康学院,陕西安康 725000)

不同红茶中主要氨基酸含量及其对小鼠自主活动的影响研究

徐欢欢1,2,3,尹丹1,2,3,刘提提1,2,3,李兆鹏4,纪昌中5,黄业伟1,2,3,*

(1.云南农业大学 普洱茶学教育部重点实验室,云南昆明 650201;2.云南省茶深加工工程技术研究中心,云南昆明 650201;3.云南农业大学 食品科学技术学院,云南昆明 650201;4.安康市林业局,陕西安康 725000;5.安康学院,陕西安康 725000)

通过高效液相色谱法(HPLC)测定不同红茶中γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、L-茶氨酸和L-谷氨酸的含量,并通过小鼠自主活动测试仪比较不同主要氨基酸含量的红茶水提物对小鼠自主活动的影响。结果表明,不同红茶中GABA、L-茶氨酸和L-谷氨酸含量差别均较大,并且L-茶氨酸含量普遍高于GABA、L-谷氨酸含量。其中,GABA含量以高黎贡山为最高,汉水韵红茶次之,紫鹃红最低;L-茶氨酸和L-谷氨酸含量均以八仙红茶为最高,汉水韵红茶次之,印度大吉岭红茶最低。此外,动物实验结果显示,与主要氨基酸含量较低红茶组相比,主要氨基酸含量较高红茶组小鼠的自主活动次数显著减少(p<0.05)。以上结果提示,主要氨基酸含量较高的红茶对小鼠具有明显的镇静作用。

γ-氨基丁酸(GABA),L-茶氨酸,L-谷氨酸,高效液相色谱法(HPLC),自主活动能力

表1 实验样品Table 1 Test samples

茶作为世界三大饮料(茶叶、咖啡和可可)之一,是一种在普遍性上仅次于水的饮品。茶汤中含有丰富的营养成分和功能性成分,对维持人体健康具有积极作用[1]。红茶是中国六大茶类之一,是以茶树的芽叶为原料,经过萎凋、揉捻(切)、发酵、干燥等工艺过程精制而成[2]。氨基酸是茶叶中主要化学成分之一,红茶中的主要氨基酸有γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、茶氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸等多种氨基酸[3]。研究表明红茶具有抗肿瘤、抗病毒、抗疲劳、镇静等功效,以及对心脑血管疾病、慢性炎症、神经退行性疾病、骨质疏松具有预防和治疗作用[4-7]。随着红茶保健功能的医学证明和人们对健康意识的日益提高,且其具有独特的品质特征,红茶越来越受到世人的青睐。

研究表明,GABA红茶提取物对睡眠具有良好的促进作用,且高剂量作用最为明显[8]。GABA是普遍存在于生物体内的一种非蛋白质氨基酸,其合成前体为谷氨酸。GABA具有镇静神经、改善脑机能、增强记忆力、改善睡眠、治疗癫痫以及精神分裂症等作用[9]。而茶氨酸是茶叶中特有且含量最高的游离氨基酸,属酰胺类化合物,是由一分子谷氨酸与一分子乙胺在茶氨酸合成酶作用下合成的,具有降血压、静心安神、改善大脑功能和抗疲劳等作用[10]。然而,关于红茶中与镇静作用相关的主要氨基酸含量的比较研究却鲜见报道。本研究选用来源于云南、陕西、印度等地的红茶为试样,通过高效液相色谱法测定样品中GABA、L-茶氨酸、L-谷氨酸的含量,并通过动物实验探讨红茶对小鼠自主活动的影响,以期为茶叶加工、消费选择、红茶保健功能研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

实验所用试样如表1所示。

GABA、L-茶氨酸、L-谷氨酸标准品 Aladdin,含量均≥99%;乙腈 美国,TEDIA,色谱纯;邻苯二甲醛 OPA,Aladdin,含量≥99%。

昆明种健康雌性小鼠12只,7～8周龄,由昆明医科大学动物中心提供。饲养环境:光暗周期为12 h;湿度:50%～60%;周围环境温度:(24±1) ℃;饲喂基础饲料;自由饮食饮水。所有动物实验均按照《实验动物管理条例》进行。

1260高效液相色谱仪 美国Agilent公司;SC-3616低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;SK-18TC超声波清洗机 上海科导超声仪器有限公司;ZZ-6小鼠自主活动测试仪 成都泰盟科技有限公司;UB-7酸度计 美国DENVER公司;HYC-360药品保存箱 青岛海尔特种仪器有限公司;FDV超微粉碎机 北京环亚天元机械技术有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 色谱条件 安捷伦荧光检测器(G1321B 1260FLD);Agilent ZORBAX Eclipse AAA-C18柱(5 μm,4.6 mm×150 mm);流动相:A相为(90 mmol/L醋酸钠,7%乙腈,pH6.5),B相为80%乙腈,梯度洗脱(表2);流速1.0 mL/min;柱温40 ℃;进样量为14 μL;25.5 min内完成,激发波长和发射波长分别为230、450 nm,每1次完成后,系统平衡10 min后再次进样[9]。

表2 梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution separation program

1.2.2 样品制备 样品茶叶粉碎成40目(0.45 mm筛),称取0.15 g,加入30 mL超纯水,置于涡旋仪上进行混匀,混匀1 min后放置于超声清洁仪内进行超声,超声辅助提取(20 min,25 ℃;频率:25 kHz;功率:100%)→离心(3000 r/min,5 min)→取上清液,过滤,检测,实验重复3次。

1.2.3 柱前衍生反应 称取10 mg OPA,用0.5 mL甲醇溶解后,加入30 μLβ-巯基乙醇过滤,制成OPA衍生试剂,避光4 ℃保存。配置0.4 mol/L,pH10.4硼酸盐缓冲溶液。进样程序见表3。

表3 进样程序Table 3 Sample program

1.2.4 小鼠自主活动的测定 用小鼠自主活动测试仪测试小鼠的水平运动和竖起运动情况。单个的测试小室长15 cm、宽12 cm、高10 cm,将小鼠测试仪置于光线昏暗且安静的房间中。实验开始之前饥饿小鼠12 h。将雌性昆明小鼠分为2组:主要氨基酸含量较低的红茶(Ⅰ)组(立顿红茶水提物,三种氨基酸总含量为0.682%)和主要氨基酸含量较高的红茶(Ⅱ)组(汉水韵红茶水提取物,三种氨基酸总含量为2.330%),每组6只小鼠。首先置小鼠于测试小室中适应性测试30 min。用超纯水配制红茶(Ⅰ)水提物(3.712 g/L)和红茶(Ⅱ)水提取物(3.712 g/L),并使样品中咖啡因的浓度均为0.25 g/L。按照体积为0.2 mL/10 g体重进行灌胃,也即咖啡因的剂量为5 mg/kg体重[11]。经口灌胃相应试样之后,立即将小鼠放入测试小室,并记录接下来120 min内小鼠的自主活动情况,统计小鼠水平和竖起运动的总次数。每测完一组之后,用75%酒精擦拭测试小室的内壁,并用吸水纸和电吹风干燥,再进行下一组实验[11]。

1.3数据分析

2 结果与分析

2.1不同红茶中主要氨基酸的含量

2.1.1 不同红茶中GABA的含量 由表4可知,不同红茶中的GABA含量差别较大。其中以高黎贡山红茶中的GABA含量为最高,在100 g样品中含量可达123.4 mg;而以汉水韵红茶、立顿红茶、滇祖红茶、2015广佛红茶、2014女娲红茶、昌宁红高山红和八仙红茶中的GABA含量为次之,每100 g样品中分别含有72.99、69.97、64.78、57.47、44.47、34.06、32.61 mg;明光珠露、紫阳富硒红茶、印度大吉岭红茶、昌宁飞龙在天、云南红茶玫瑰香和紫娟红中的GABA含量较少,每100 g样品中依次含有28.66、12.88、12.37、9.20、3.62、3.10 mg,且相互之间具有显著差异性(p<0.05)。

表4 不同红茶中GABA含量Table 4 The GABA content in different black tea

表5 不同红茶中L-茶氨酸含量Table 5 The L-theanine content in different black tea

2.1.2 不同红茶中L-茶氨酸的含量 由表5可知,不同红茶中的L-茶氨酸含量差别很大。其中以八仙红茶中的L-茶氨酸含量为最高,在100 g样品中含量可达1614.47 mg;而以汉水韵红茶、昌宁飞龙在天、紫阳富硒红茶、高黎贡山、紫娟红、2015广佛红茶、昌宁红高山红、2014女娲红茶中的L-茶氨酸含量为次之,每100 g样品中分别含有1377.83、1086.84、1015.09、952.28、874.31、867.13、841.00、833.96 mg,且前五种红茶相互之间差异显著(p<0.05),后四种红茶相互之间则无显著性差异(p>0.05);滇祖红茶、明光珠露、立顿红茶、云南红茶玫瑰香、印度大吉岭红茶中的L-茶氨酸含量较少,每100 g样品中依次含有652.03、457.50、387.52、386.97、349.96 mg,且前三种红茶相互之间差异显著(p<0.05),后三种红茶相互之间则无显著性差异(p>0.05)。

2.1.3 不同红茶中L-谷氨酸的含量 由表6可知,不同红茶中的L-谷氨酸含量差异较大,且相互之间均具有显著性差异(p<0.05)。其中以八仙红茶中的L-谷氨酸含量为最高,在100 g样品中含量可达278.28 mg;而以汉水韵红茶、紫阳富硒红茶、2015广佛红茶、立顿红茶、昌宁飞龙在天、高黎贡山、明光珠露、2014女娲红茶中的L-谷氨酸含量为次之,每100 g样品中分别含有183.89、129.13、118.86、108.50、96.38、82.81、78.12、71.63 mg;滇祖红茶、昌宁红高山红、紫娟红、云南红茶玫瑰香、印度大吉岭红茶中的L-谷氨酸含量较少,每100 g样品中依次含有61.61、60.02、54.83、42.32、33.13 mg。

表6 不同红茶中L-谷氨酸含量Table 6 The L-glutamic acid content in different black tea

2.2不同红茶水提物对小鼠自主活动的影响

以小鼠自主活动次数为量化指标,在摄入等量咖啡因后,比较红茶(Ⅰ)水提物和红茶(Ⅱ)水提物对小鼠的刺激作用,结果如图1所示。结果显示,与红茶(Ⅰ)组相比,红茶(Ⅱ)组小鼠的自主活动次数显著减少(p<0.05),提示主要氨基酸含量较高的红茶对小鼠具有明显的镇静作用。

图1 小鼠的自主活动水平Fig.1 Locomotor activity levels of the mice注:数值以表示(n=6),与红茶(Ⅰ)组相比,*p<0.05。

3 结论与讨论

氨基酸是茶叶中重要的含氮物质,是合成许多与代谢产物有关的生理活性物质前体[12]。游离氨基酸是茶叶中重要的营养成分和药理成分,茶汤中的氨基酸不仅具有缓和咖啡因引起中枢神经过度兴奋的作用[13-15],亦具有降压、安神、消除疲劳、增强免疫力、预防和治疗中枢神经系统疾病等作用[16-18]。因此,通过饮茶可以摄取多种氨基酸,有利于维持人体内正常的生理功能。

研究结果表明,GABA含量最高的是产地为腾冲县的高黎贡山红茶,其L-茶氨酸含量也颇高,但L-谷氨酸含量则较低。而与它产地同样为腾冲的明光珠露中三种氨基酸的含量都不高。均位于陕西安康的汉水韵红茶、2015广佛红茶、2014女娲红茶、八仙红茶中的三种氨基酸含量都普遍偏高,且它们之间差异显著。处于陕西紫阳的紫阳富硒红茶较产地陕西安康的四种茶样相比,其GABA含量偏低,但L-茶氨酸和L-谷氨酸含量虽没有八仙红茶和汉水韵红茶高,但比2015广佛红茶和2014女娲红茶偏高。地处普洱和勐海的紫娟红和玫瑰香中的GABA和L-谷氨酸的含量均偏低,但其L-茶氨酸含量偏高,且二者差异性显著。同属昌宁红公司的滇祖红茶、高山红和飞龙在天红茶之间虽产地都是保山,但同样具有明显差异。三者的GABA和L-谷氨酸含量在同组茶样中都较低,但L-茶氨酸的含量却较高,且具有明显差异性。究其原因,主要是因为茶叶产地位置、气候、土壤环境、降雨量以及茶叶加工工艺等均不同,其氨基酸含量差异较大。

值得注意的是,茶叶中L-谷氨酸虽然可以转化为L-茶氨酸和GABA,但不代表茶叶中含量最多的氨基酸为L-谷氨酸。通过对红茶中三种主要氨基酸的含量测定以及不同红茶提取物对小鼠自主活动水平的影响,不难看出红茶中主要氨基酸的含量高低与其对小鼠的刺激作用密切相关。在摄入等量咖啡因后,相比于主要氨基酸含量较低的红茶(Ⅰ)组,主要氨基酸含量较高的红茶(Ⅱ)组小鼠的自主活动次数显著降低。以上结果提示,主要氨基酸含量较高的红茶对小鼠具有明显的镇静作用。但是,关于红茶中GABA、L-茶氨酸以及L-谷氨酸对小鼠具有镇静作用的具体机制有待深入研究。

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Comparisonofthemainaminoacidscontentindifferentblackteaanditseffectonlocomotoractivityofmice

XUHuan-huan1,2,3,YINDan1,2,3,LIUTi-ti1,2,3,LIZhao-peng4,JIChang-zhong5,HUANGYe-wei1,2,3,*

(1.Key Laboratory of Pu-er Tea Science,Ministry of Education,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;2.Tea Research Center of Yunnan,Kunming 650201,China;3.Faculty of Food Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;4.Forestry Bureau of Ankang,Ankang 725000,China;5.Ankang University,Ankang 725000,China)

Theγ-aminobutyric acid(GABA),L-theanine and L-glutamic acid contents in different black tea were determined by high-performance liquid chromatography(HPLC),and the effects of black tea water extract at different main amino acids contents on the locomotor activity of mice were monitored using a mouse activity monitor system. The results showed that the contents of GABA,L-theanine and L-glutamic acid were different in the different black tea samples,and the content of L-theanine was higher than that of GABA and L-glutamic acid. Among them,the GABA content in Gaoligongshan was the highest,followed by Haishuiyun black tea,and Zijuanhong was the lowest;the L-theanine and L-glutamic acid contents in Baxian black tea were the highest,followed by Haishuiyun black tea,and India Darjeeling black tea were the lowest. Additionally,the result of animal experiment showed that the locomotor activity level in the black tea with higher main amino acids content group was significantly decreased compared with that in the black tea with lower main amino acids content group(p<0.05). The above results suggested that black tea with a high content of main amino acids had a significant sedative effect on mice.

γ-aminobutyric acid(GABA);L-theanine;L-glutamic acid;high-performance liquid chromatography(HPLC);locomotor activity

2017-03-22

徐欢欢(1991-),男,博士研究生,研究方向:功能食品开发和保健功效机理研究,E-mail:xuhuan1017@163.com。

*通讯作者:黄业伟(1985-),男,博士,研究方向:茶叶生化和保健功效机理研究,E-mail:lichuangyewei100@163.com。

云南省应用基础研究计划青年项目(2016FD026);云南省教育厅科学研究基金项目(2017YJS025)。

TS201.4

:A

:1002-0306(2017)17-0300-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.059