菠菜表面农残的SERS无损检测方法研究

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(北京工商大学计算机与信息工程学院,食品安全大数据技术北京市重点实验室，北京100048)

菠菜表面农残的SERS无损检测方法研究

刘翠玲,邢瑞芯*,孙晓荣,赵琦

(北京工商大学计算机与信息工程学院,食品安全大数据技术北京市重点实验室，北京100048)

本文针对菠菜农药残留量超标问题,建立了一种能够快速、无损地对菠菜表面农药残留量进行检测的方法。利用表面增强拉曼光谱技术(SERS,Surface Enhanced Raman Scattering)采集含农药(溴氰菊酯)和不含的两组菠菜样本的SERS光谱,结合一阶导加Norris求导法、Savitzky-Golay卷积求导法进行光谱预处理,使用判别分析法和距离匹配法建立定性分析模型,成功区分两组菠菜样本,模型预测准确率最高可达到100%;使用偏最小二乘法建立了菠菜表面溴氰菊酯残留量的多个定量分析模型,研究发现差谱模型效果最好,其校正集相关系数(Rc)和预测集相关系数(Rp)分别为0.9908,0.9552,校正均方根误差(RMSEC)和预测均方根误差(RMSEP)分别为0.0802,0.23。结果表明,运用SERS方法能够很好地实现菠菜表面溴氰菊酯残留量的无损定性和定量检测分析,且无需任何前处理,对其它农产品中农药残留量的快速、无损检测具有借鉴意义。

SERS,无损检测,菠菜,溴氰菊酯

我国是世界果蔬生产和消费大国,每年出口总量一直稳居世界前列。菠菜作为常见叶菜的一种,备受人们喜爱。但在近年来中国的蔬菜出口贸易中,菠菜屡屡被拒的问题引起社会广泛关注,其主要原因是农药残留量超标。特别是出口日本冷冻菠菜中毒死蜱超标事件[1-3],使得研究一种快速、无损的菠菜中农药残留量检测的方法成为必要。众所周知,蔬菜生长过程中易发病害较多,会严重影响菠菜长势、产量与质量。为此,不少菜农大量使用农药进行高温喷洒灭杀害虫或去除病害,甚至有部分菜农在安全间隔期内就收获菠菜上市。这些利益所趋的做法均导致菠菜中农药残留量超标现象产生。因此,研究菠菜中农药残留量的快速、无损检测,对于食品质量安全和我国的蔬菜经济发展十分重要。

表1 溴氰菊酯物化信息表Table 1 Physical chemistry information of deltamethrin

传统的果蔬中农药残留量的检测主要依靠理化检测方法,包括色谱法、色谱-质谱联用法以及直接竞争酶联免疫吸附分析法等经典化学方法[4-6],但这些方法存在前处理复杂,耗时耗力,不利于及时监测等缺陷。各种现代光谱分析检测技术的出现为我们提供了一种新的解决思路。尤其是近几年来迅速发展的表面增强拉曼光谱(SERS)技术,它作为拉曼光谱技术的一种,由于所需样本浓度低、灵敏度高等特点,在食品与农产品安全检测方面得到越来越多的重视[7]。目前已有学者利用SERS技术对大白菜汁中马拉硫磷[8]、橘子汁中毒死蜱[9]、苹果汁中亚胺硫磷[10]残留量进行检测,并取得较好的结果。但这些研究多是对果蔬的碎片或汁液进行检测,必须对果蔬本身造成一定程度的破坏,剥夺了果蔬的食用价值,造成浪费。因此,我们旨在探索一种直接对完整果蔬进行无损检测的方法,即确保果蔬食用性能不受影响和损害的前提下,对其指标快速检测,提高果蔬产品的安全性。目前,鲜有报道利用SERS技术对完整菠菜实现无损检测[11]。因此,如何利用SERS技术实现果蔬的无损检测仍值得我们探索与研究。

针对以上问题,本研究选择完整菠菜为基底,采集无溴氰菊酯及含溴氰菊酯的菠菜的SERS光谱,尝试对其表面溴氰菊酯残留量进行快速、无损检测。其中,溴氰菊酯是菠菜中常用的一种杀虫剂,对于蔬菜和果树等害虫的防治十分有效[12]。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

菠菜 市售,叶片大小、颜色均匀一致;溴氰菊酯农药:乳油制剂,有效成分含量为25 g/L 购自德国拜耳作物科学(中国)有限公司,生产日期2016/3/2,详细物化信息见表1;表面增强剂:Easy Peak(舒峰TM)科研型2号银溶胶 购自上海纳腾仪器有限公司。

DXR激光共焦显微拉曼光谱仪 美国Thermo Fisher Scientific公司生产,有效探测范围是0～3500 cm-1,实验前用聚乙烯对拉曼光谱仪进行峰位校准。

1.2溶液配制

依据国标GB 2763-2014食品中农药残留最大残留限量的规定,菠菜中溴氰菊酯含量不得超过0.5 mg/kg,因此实验实施方案如下:

配制不同浓度的溴氰菊酯标准溶液15个,以去离子水为溶剂,25 g/L溴氰菊酯乳油为溶质,质量分数在0.05～2 mg/kg之间分布。选取15片形状、大小、颜色基本一致的新鲜菠菜叶片,用去离子水洗净后,置于常温下自然干燥。为去除叶片差异,做一组平行样本。共计30个样本。

为确保实验可行性,首先进行了SERS技术检测溴氰菊酯水溶液可行性的预实验。配制浓度为100 mg/L的溴氰菊酯标准母液,并依次将母液稀释为10,5,1,0.5,0.1,0.1,0.05 mg/L的标准溶液。

1.3光谱采集

实验发现,由于浓度较低,无法观测到溴氰菊酯溶液的拉曼信号。后期加入表面增强剂(按溴氰菊酯溶液与增强剂1∶1的体积比混合),采集其SERS光谱;同时为排除溶液中水、增强剂的干扰,分别采集各自的SERS光谱。三者的光谱如图1中所示,水、表面增强剂的SERS信号基本为零,排除水、增强剂的检测干扰,溴氰菊酯溶液的SERS信号十分显著,在227,2935 cm-1处拉曼强度明显,且400～1700 cm-1之间存在众多低峰,这为该研究提供可能。

图1 水、增强剂和溴氰菊酯标准溶液的SERS光谱Fig.1 SERS of water,enhancer and deltamethrin standard solutions

本实验选取颜色均匀的新鲜菠菜样本30个,每15个为一组,将所有样本分为2组。首先,使用移液枪往所有样本表面滴加一定量的表面增强剂,依次放在包裹锡纸的载玻片上、对增强剂部位进行面扫描;其次,取1.2中的溴氰菊酯标准溶液滴加于样本的增强剂部位,自然晾干后进行面扫描。实验最终得到含或不含溴氰菊酯的菠菜样本面扫描谱图共计60张。

其中,实验仪器的各项参数设置为:奥林巴斯BX51研究级显微镜,10X目镜聚焦,激光波长780 nm,激光能量24 mW,光栅400 lines/mm,光阑50,估计分辨率4.7～8.7 cm-1,采集曝光时间5 s,选择荧光修正。面扫描步长50 μm×50 μm,点数2×2。

1.4预处理及建模方法

适当预处理与建模方法结合,能够进一步提取有效光谱信息,得到更好的模型结果。

导数是光谱领域常用的预处理方法之一,常见的有:直接差分法、Norris求导法和Savitzky-Golay卷积求导法,它们各有各的特点。直接差分法可有效地消除基线和其他背景的干扰,提高分辨率和灵敏度,但同时可能会导致信噪比下降[10];Norris求导法能够在求导前对原始光谱进行平滑去噪,在提取特征峰的同时也能够消除光谱变换带来的噪声影响;Savitzky-Golay卷积求导法是目前应用较广泛的去噪方法,尽可能减小平滑对有效信息的影响[13]。

本研究使用的预处理如下:选取3～4个特征波段,并采用Norris求导法、Savitzky-Golay卷积求导法,或分别与一阶求导结合的多种处理方法,旨在提高分辨率和提取特征峰的同时,尽可能减小光谱变换带来的噪声影响。

建立模型时,本研究使用判别分析(Discriminant Analysis,DA)和距离匹配(Distance Match,DM)两种常见的分类算法[14],建立无或含溴氰菊酯的两组菠菜样本定性分析模型。定量模型则采用经典的偏最小二乘算法,分别建立菠菜表面溴氰菊酯的原始光谱及其差谱模型。差谱是指用含溴氰菊酯的菠菜SERS光谱减去无溴氰菊酯的菠菜SERS光谱,得到光谱即为差谱。此操作理论上可以消除菠菜基底影响,得到近似溴氰菊酯水溶液的SERS光谱[15-16]。

2 结果与分析

2.1基本处理

本实验仪器采集得到的原始光谱是样本的面扫描谱图,每张谱图由固定区域内的4个点光谱组成。因此,首先将面扫描谱图进行基本处理,即拆分成4张点光谱图,并求算数平均获得平均谱图。随后手动剔除4个光谱差异较大的奇异样本,剩余有效样本56个。此外,由于有效样本光谱也存在漂移严重的现象,选择线性拟合方法进行基线校正。校正后的无溴氰菊酯及含溴氰菊酯的菠菜的SERS光谱分别如图2a、图2b所示。

图2 基线校正后的光谱Fig.2 Spectra after baseline

图2a中,700～1700 cm-1波段为菠菜拉曼峰的主要集中区域。其中,1157 cm-1和1527 cm-1处有两个比较明显的波峰,有文献记载是由菠菜中叶绿素外琳环的C-O-C和C=C双键振动所引起的;745,1186、1327 cm-1处存在众多低峰,可能与菠菜中的维生素、固形物含量等成分有关[17]。但两张图表现出较大的相似性,特征峰位差异较小,不易分辨。

这是由于在SERS光谱采集过程中,由于菠菜样本基底复杂,容易产生很强的荧光背景,因而使有效信号变差甚至被淹没;此外,样本浓度配制较低,导致所呈现的光谱信噪比不高,无法完整的反映物质本身的性质、结构。因此需选择适当的预处理方法对光谱进行处理,进一步提取有效光谱信息,以得到更好的建模数据与结果。

2.2定性分析

使用Norris 5点求导后的光谱,建立判别分析和距离匹配模型,对无溴氰菊酯及含溴氰菊酯的两组菠菜样本做定性分析。在图3a判别分析模型中,横坐标为样本距含溴氰菊酯的菠菜类别(记为类别2)的马氏距离,纵坐标为样本距无溴氰菊酯的菠菜类别(记为类别1)的马氏距离,图中的直线为距离横纵坐标距离相等点的直线。建模结果显示,样本的大多数都能划分正确,但受菠菜基底复杂和样本浓度过低影响,有4个建模集样本出现了分类错误。随后随机选择校验集样本9个作为测试样本,均划分正确。但为进一步验证,采用距离匹配方法建立模型。

图3b为距离匹配模型,横坐标为样本距类别1的马氏距离,纵坐标为样本距类别2的马氏距离,随机挑选12个样本对模型进行测试,所有样本都比较准确地被划分到自身所属类别当中,定性准确率达到100%。

由于两个模型中校验集样本存在浓度相同及相近的情况,只标出了若干校验集样本,为更清楚的说明预测结果,模型的具体预测结果如表2、表3所示。其中,类别1为无农药菠菜样本,类别2为含溴氰菊酯菠菜样本。可以看到,两组预测样本都被正确分类,预测正确率为100%。

图4 定量模型拟合曲线Fig.4 Quantitative analysis models 注:(a)模型1,(b)模型2,(c)模型3拟合曲线图,(d)模型3残差图，具体模型见表5。

序号距纯净菠菜的距离距含DM菠菜的距离实际类别预测类别10.23570.72031120.33360.84821130.41570.83391140.19720.78521150.5730.88411170.87060.40392281.28960.71162291.52271.069622

表3 距离匹配定性识别结果Table 3 Distance match result

从定性结果来看,采用SERS技术结合距离匹配、判别分析方法来研究菠菜表面溴氰菊酯残留均能得到较好的定性结果,但距离匹配模型的结果要更好一些。

2.3定量分析

定性分析很好地区分了无溴氰菊酯和含溴氰菊酯的两组菠菜样本,为准确预测菠菜表面溴氰菊酯的具体含量提供可能。在定量分析中,采用经典的偏最小二乘算法(PLS)结合多种预处理方法,分别建立了菠菜表面溴氰菊酯的原始光谱及其差谱模型。部分模型结果见图4。对比发现,差谱模型结果明显优于原始光谱,其校正集相关系数可达到0.99以上,随机挑选了5个样本作为测试集后的相关系数也可达到0.95以上。

图4c、图4d所示为模型3的拟合曲线和残差图,箭头所指的为本次实验的5个测试样本。可以看到,基于差谱法的菠菜表面溴氰菊酯样本定量分析模型的拟合效果较好,最佳因子数为6,校正结果的相关系数均可达到0.99以上,预测结果的相关系数也可达到0.95以上,模型RMSEC和RMSEP也均在可接受范围内。残差图中,预观值相对于真实值都有一定的偏差,但除个别样本外,其余测试样本的残差比均在50%以下,同样可以满足农药制剂市场的要求。具体预测结果见表4所示。

表5为不同预处理方法下的部分定量模型对比。可见,选择3个特征波段、采用一阶导数加Savitzky-Golay求导建立的PLS定量模型结果最好,其各项模型评价指标都明显优于其他模型。

表5 部分定量模型对比Table 5 Different quantitative models

表4 测试结果Table 4 Test result

3 结论

本研究采用表面增强拉曼光谱技术,得到了一种能够快速、无损的对菠菜表面溴氰菊酯残留量进行检测的方法,具有较为重要的实际意义。其中,定性分析成功区分含农药(溴氰菊酯)与不含的两组菠菜样本,基于距离匹配算法的定型模型预测准确率高达100%;采用差谱建立的偏最小二乘定量模型较好地消除了菠菜基底干扰,准确预测了菠菜表面溴氰菊酯的具体含量,模型校正集相关系数(Rc)和预测集相关系数(Rp)分别为0.9908,0.9552,校正均方根误差(RMSEC)和预测均方根误差(RMSEP)分别为0.0802,0.23。结果表明,该研究方法具有较高的实用价值,今后也可推广到其他果蔬农药残留量的无损检测中去。不过,此次实验样本数量较少,为了提高模型稳定性和精确度,后期将增加样本数量,进一步扩充和完善实验。

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ResearchonnondestructivedetectionofpesticideresidueinspinachbySERS

LIUCui-ling,XINGRui-xin*,SUNXiao-rong,ZHAOQi

(School of Computer and Information Engineering,Beijing Technology and Business University, Beijing Key Laboratory of Big Data Technology for Food Safety,Beijing 100048,China)

A method for rapid and nondestructive detection of pesticide residues on spinach surface by using surface enhanced raman scattering(SERS)was built in this paper. SERS of spinach samples with and without deltamethrin were pretreated with some methods such as first derivation,Norris derivation and Savitsky-Golay convolution derivation. Discriminant analysis and distance match method were used to build qualitative model for determination of spinach samples with and without deltamethrin,and the highest accuracy rate of prediction was proved to be 100%. Then several quantitative models of those samples contained deltamethrin pesticide were built with partial least squares(PLS). The results showed that the best model was built with the differential spectrum. The correlation coefficient of calibration(Rc)and the correlation coefficient of validation(Rp)of the best model were 0.9908,0.9552 respectively. The root mean square error RMSEC and the root mean square error RMSECV were 0.0802,0.23 respectively. All results indicated that this method can be used for a rapid and nondestructive detection of deltamethrin on spinach,as well as other agricultural products.

SERS;nondestructive detection;spinach;deltamethrin

2017-02-07

刘翠玲(1963-)，女，博士，教授，研究方向：智能测量技术与数据处理、系统建模与仿真方法研究、智能控制方法，E-mail：liucl@btbu.edu.cn。

*通讯作者:邢瑞芯(1993-)，女，硕士，研究方向：光谱检测技术与信息处理，E-mail:xing19930528@126.com。

北京市自然科学基金项目(4142012)。

TS255.1

:A

:1002-0306(2017)17-0245-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.047