HPLC-MS/MS法同时测定玄参中8个成分的含量△

周佳，齐红艺

(1.四川省食品药品检验检测院，四川 成都 611731；2.西南大学，重庆 400715)

·基础研究·

HPLC-MS/MS法同时测定玄参中8个成分的含量△

周佳1*，齐红艺2

(1.四川省食品药品检验检测院，四川 成都 611731；2.西南大学，重庆 400715)

目的：建立HPLC-MS/MS法同时测定玄参中梓醇、哈巴苷、栀子苷、类叶升麻苷、安格洛苷C、肉桂酸、哈巴俄苷、5-羟甲基糠醛8个成分的含量。方法：采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)，柱温为30 ℃，以甲醇-0.05%甲酸水为流动相，梯度洗脱，流速为0.6 mL·min-1，进样量2 μL，ESI源，正离子-MRM模式下检测；结果：梓醇、哈巴苷、栀子苷、类叶升麻苷、安格洛苷C、肉桂酸、哈巴俄苷、5-羟甲基糠醛质量浓度分别在0.194 0～7.76(r=0.999 0)、0.173 8～32.85(r=0.999 8)、0.394～23.64(r=0.996 4)、0.279 5～16.77(r=0.997 4)、0.3095～12.38(r=0.999 4)、0.087～5.220(r=0.999 1)、0.264 5～31.74(r=0.999 8)、0.034 3～1.370 0 μg·mL-1(r=0.999 2)线性关系良好，检出限(LOD)为5～50 ng·mL-1，平均回收率为91.33%～99.78%。样品测定结果显示，玄参中哈巴俄苷、哈巴苷及安格洛苷C含量较高，分别为1.517～9.735、0.289～5.997、0.898～3.568 mg·g-1。不同来源的样品中，8个成分的含量及各个成分之间比例存在较大差异。结论：本实验建立了在22 min内同时测定玄参中8个成分含量的方法，灵敏度高，准确度好，实验结果可为玄参质量提供参考。

玄参；梓醇；哈巴苷；栀子苷；类叶升麻苷；安格洛苷C；肉桂酸；哈巴俄苷；5-羟甲基糠醛；HPLC-MS/MS

传统中药玄参(Radix Scrophulariae)是玄参科植物浙玄参ScrophularianingpoensisHemsl.的干燥根[1]，性微寒，味甘、苦、咸，归肺、胃、肾经；具有凉血滋阴、泻火解毒的功效[2]。玄参中主要含有环烯醚萜苷和苯丙素苷等[3-4]，具有镇痛、消炎、抗菌、保肝、抗氧化、免疫调节、降血压、神经保护等作用[5-7]。玄参中测定哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸、安格洛苷C的HPLC法已有报道[8]，但用HPLC-MS/MS法同时测定玄参中梓醇、哈巴苷、栀子苷、类叶升麻苷、安格洛苷C、肉桂酸、哈巴俄苷、5-羟甲基糠醛8个成分的含量未见报道。本实验建立具有高灵敏度、高选择性的HPLC-MS/MS法对玄参中这8个成分进测定，并测定了不同产地玄参药材的8个成分的含量，为全面控制玄参质量奠定基础。

1 仪器与试剂

1.1材料

9批次玄参(产自重庆秀山，河北，四川北川、雅安、巫山、宝兴，贵州、河南、湖南)经四川省食品药品检验检测院黎跃成主任药师鉴定为玄参正品。

1.2仪器

高效液相色谱仪-三重四级杆质谱联用仪(Agilent1290-6460，MussHunter工作站)；SartoriusCPA225D型电子天平；Milli-Q超纯水仪；超声仪(上海冠特超声仪器公司)。

1.3试剂与对照品

1.3.1试剂 甲醇、超纯水。

1.3.2对照品 梓醇(批号：110808-200508，99.5%)购自中国食品药品检定研究院，哈巴苷(批号：Must-12121902，≥95%)、栀子苷(批号：Must-13041809，≥95%)、类叶升麻苷(批号：Must-13051002，≥95%)、安格洛苷C(批号：Must-13051502，≥95%)、肉桂酸(批号：Must-12123102，≥95%)、哈巴俄苷(批号：Must-12071801，≥95%)、5-羟甲基糠醛(5-HMF)(批号：Must-12110805，≥95%)购自成都曼斯特生物科技有限公司。

2 方法与结果

2.1混合对照品溶液的制备

精密称定梓醇、哈巴苷、栀子苷、类叶升麻苷、安格洛苷C、肉桂酸、哈巴俄苷、5-羟甲基糠醛(5-HMF)对照品适量，分别置棕色量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至各量瓶中，得单一对照品储备液。精密量取上述各储备液适量，用50%甲醇水配制成混合对照品中间液，质量浓度为梓醇38.8μg·mL-1、哈巴苷54.75μg·mL-1、栀子苷78.8μg·mL-1、类叶升麻苷55.9μg·mL-1、安格洛苷C61.9μg·mL-1、肉桂酸17.4μg·mL-1、哈巴俄苷52.9μg·mL-1、5-羟甲基糠醛6.85μg·mL-1，备用。

2.2供试品溶液的制备

取各玄参，粉碎(过三号筛)，称取粉末，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入50%甲醇水溶液50mL，称重，放置30min，超声处理45min(功率300W，频率45kHz)，放冷，再称重，用50%甲醇水溶液补足减失的重量，过滤，取续滤液，过0.22μm微孔滤膜，即得。

2.3色谱条件

色谱柱：AgilentZORBAXEclipseXDB-C18(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：0.05%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0～5min，60%～60%A；5～8min，60%～40%A；8～19min，40%～20%A；19～19.1min，20%～60%A；19.1～22min，60%～60%A)；流速：0.6mL·min-1；柱温：35℃；进样量：2μL。

2.4质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子模式；检测方式：多反应监测(MRM)方式，干燥气流速：7.0L·min-1，干燥气温度：300℃；毛细管电压：3500V，四级杆温度：100℃，检测化合物离子参数见表1，对照品及玄参样品的MRM总离子流图见图1，各化合物的提取色谱图见图2。

2.5线性关系及检测下限考察

取2.1项下混合对照品中间液适量，用50%甲醇水溶液稀释成系列混合对照品溶液(每个化合物至少测定5个浓度水平)，照上述方法进行测定，记录峰面积，以对照品浓度(μg·mL-1)为横坐标，以相应的峰面积为纵坐标，进行线性回归，计算回归方程。同时以信噪比(S/N)3∶1及10∶1为基准分别测定各化合物的检出限及定量限，结果见表2；结果表明各化合物在下列质量浓度(见表2)范围内线性关系良好，检出限在5～50 ng·mL-1，定量限在17～167 ng·mL-1。

表1 检测化合物离子参数

2.6稳定性试验

取2.2项下制备的供试品溶液，室温放置，分别在0、2、4、8、12、48 h进样测定，记录其峰面积。结果各时间段梓醇、哈巴苷、栀子苷、类叶升麻苷、安格洛苷C、肉桂酸、哈巴俄苷、5-羟甲基糠醛峰面积的RSD分别为2.11%、1.95%、2.22%、3.91%、2.15%、1.44%、1.64%、4.01%，表明供试品在48 h内稳定。

2.7加样回收试验

精密称取已测定含量的玄参样品(样品编号1)粉末约0.1g，共9份，分别精密加入低、中、高3个水平的单一对照品溶液，每个浓度3份，按2.2项下制备加样回收率测定样品溶液，进样测定，记录峰面积，计算各化合物的平均回收率，结果见表3。回收率在91.33%～99.78%，RSD%小于5.3%，表明准确度良好。

2.8样品含量测定

取各个玄参样品约0.2g，精密称定，按2.2项下供试品溶液方法制备，进样测定，计算含量，结果见表4。

图2 玄参中8个化合物的提取色谱图

成分回归方程r线性范围/μg·mL-1检出限/ng·mL-1定量限/ng·mL-1类叶升麻苷Y=359.7X+77.80.99740.2795～16.7750167哈巴俄苷Y=1804.8X-259.10.99980.2645～31.7410335-HMFY=70989.4X+1671.70.99920.0343～1.3700517哈巴苷Y=12871.1X-1856.30.99980.2738～32.851033肉桂酸Y=58021.8X+964.60.9991 0.087～5.220827栀子苷Y=4142.0X+828.90.9964 0.394～23.6440133安格洛苷CY=825.6X-148.20.99940.3095～12.3830100梓醇Y=1125.9X-91.30.99900.1940～7.76 2067

表3 玄参中8种化合物的加样回收试验结果(n=3)

表3(续)

表4 不同来源玄参中8个成分含量 /mg·g-1

3 讨论

3.1 HPLC-MS/MS法同时测定玄参中8个成分较HPLC法的优势

玄参药材中含有多种成分，杂质较多，用HPLC法测定8个成分[9]，色谱分离难度较大，如果强行分离，分析时间会长达50 min以上，并且选择性较HPLC-MS/MS法差；如果加上过多净化步骤，操作繁琐，费时，容易造成损失，回收率下降，用HPLC-MS/MS法可以同时分析玄参中8个成分，提取离子流图几乎看不到任何其他物质的干扰，分析时间短(22 min内)，回收率高，适用于上述成分的同时测定。

3.2质谱条件的选择

化合物在质谱中以[M+Na]+或[M+NH4]+存在，在甲酸作用下，供试液呈酸性，正模式下，有助样品离子化。对甲酸浓度(0.05%、0.1%、0.2%)进行考察，发现灵敏度差距不大，最终选择甲醇-0.05%甲酸水溶液作为流动相。

3.3提取条件的优化

考察不同提取溶剂(甲醇、70%甲醇水、50%甲醇水、30%甲醇水、水)、不同提取方式(加热回流、超声)及提取时间(10、20、30、45、60min)和提取次数(1、2、3次)，最终确定称取药材粉末0.2g、用50%甲醇水溶液提取45min、50mL分两次提取为最佳提取条件。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：117.

[2] 肖培根.新编中药志[M].北京：化学工业出版社，2002：336.

[3] 胡瑛瑛，黄真.玄参的化学成分及药理作用研究进展[J].浙江中医药大学学报，2008，32(2)：268.

[4] 邹臣亭，杨秀伟.玄参中一个新的环烯醚萜糖甙化合物[J].中草药，2000，31(4)：241-243.

[5] 李静，陈长勋，高阳，等.玄参提取物抗炎与抗动脉硬化作用的探索[J].时珍国医国药，2010，21(3)：532.

[6]GuWL，ChenCX，WuQ，etal.EffectsofChineseherbmedicineRadixScrophulariaeonventricularremodeling[J].Pharmazie，2010，65(10)：770-775.

[7]SunX，XiongZ，ZhangY，etal.HarpagosideattenuatesMPTP/MPP+induceddopaminergicneurodegenerationandmovementdisorderviaelevating glial cell line-derived neurotrophic factor[J].J Neurochem，2012，120(6)：1072.

[8] 张雪梅，王瑞，安睿，等.HPLC同时测定玄参中5种成分的含量[J].中国中药杂志，2011，36(6)：709-711.

[9] Cao G，Cong X D，Cai H，et al.Simultaneous quantitation of eight active components in crude and processed Radix Scrophulariae extracts by high performance liquid chromatography with diode array detector[J].Chin J Nat Med，2012，10(3)：213-217.

SimultaneousDeterminationofEightComponentsinRadixScrophulariaebyHPLC-MS/MS

ZHOU Jia1*，QI Hongyi2

(1.SichuanInstituteforFoodandDrugControl,Chengdu611731，China; 2.SouthwestUniversity,Chongqing400715，China)

Objective：To establish a method for simultaneous determination of eight components in Radix Scrophulariae including catalpol，harpagoside，geniposide，acteoside，angoroside C，cinnamic acid，harpagide，5-HMF.Methods：Chromatographic separation was performed on an Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 column (150 mm × 4.6 mm，5 μm) at 30 ℃ of column temperature.0.05% aqueous formic acid (A) and methanol (B) were adopted as mobile phase with a gradient elution.The flow rate was set at 0.6 mL·min-1.The injection volume was 2 μL.Detection was carried out on a triple quadrupole mass spectrometer in the positive ion mode using an electrospray source.Multiple reaction monitoring(MRM) mode was employed.Results：The developed method showed good linearity in the range of 0.194 0-7.76 μg·mL-1(r=0.999 0) for catalpol，0.173 8-32.85 μg·mL-1(r=0.999 8) for harpagoside，0.394-23.64 μg·mL-1(r=0.996 4) for geniposide，0.279 5-16.77 μg·mL-1(r=0.9974) for acteoside，0.309 5-12.38 μg·mL-1(r=0.999 4) for angoroside C，0.087-5.220 μg·mL-1(r=0.9991) for cinnamic acid，0.264 5-31.74 μg·mL-1(r=0.999 8) for harpagide，0.034 3-1.370 0 μg·mL-1(r=0.999 2) for 5-HMF，respectively.The limit of detection was 5-50 ng·mL-1.The recoveries varied between 91.33%-99.78%.Harpagide，harpagoside and angoroside C were found to be the most abundant components in Radix Scrophulariae.There were significant differences in distribution of these components among the samples from different origins.Conclusion：The established method of determination of 8 kinds of component content in Radix Scrophulariae within 22 min is proved to be accurate and sensitive.The experimental results can provide reference for the quality of Radix Scrophulariae.

Radix Scrophulariae；catalpol；harpagoside；geniposide；acteoside；angoroside C；cinnamic acid；harpagide；5-HMF；HPLC-MS/MS

重庆市科技人才培养(创新青年科技人才培养)项目(cstc2013kjrc-qnrc10002)

] 周佳，主管药师，硕士，研究方向：食品药品检验；E-mail：275946785@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.015

2016-12-30)

*[