大叶蛇葡萄提取物对SMMC-7721细胞增殖抑制作用的研究△

黄静，桂春，答国政，尚祥伟，明小芳，张秀桥

(湖北中医药大学 药学院，湖北 武汉 430065)

·基础研究·

大叶蛇葡萄提取物对SMMC-7721细胞增殖抑制作用的研究△

黄静，桂春，答国政，尚祥伟，明小芳，张秀桥*

(湖北中医药大学 药学院，湖北 武汉 430065)

目的：研究大叶蛇葡萄叶及嫩茎提取物对SMMC-7721细胞增殖的影响，筛选其有效抗肿瘤活性物质。方法：采用MTT法检测不同质量浓度的大叶蛇葡萄石油醚萃取物部位、乙酸乙酯萃取物部位及水溶性物部位，以及该植物中含有的蛇葡萄素、杨梅素、杨梅苷、大黄素及槲皮素分别作用24、48、72 h后对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用。结果：乙酸乙酯萃取物部位和大黄素均能不同程度地抑制SMMC-7721细胞增殖，乙酸乙酯萃取物部位对细胞的抑制作用在100 μg·mL-1时具有一定的时效关系，大黄素对细胞的抑制作用在40、80、160 μmol·L-1时也具有一定的时效关系，乙酸乙酯萃取物部位和大黄素作用SMMC-7721细胞72 h的IC50分别为110.81 μg·mL-1和53.20 μmol·L-1。结论：大叶蛇葡萄提取物具有较好的体外抗肿瘤活性。

大叶蛇葡萄；SMMC-7721细胞；增殖抑制

大叶蛇葡萄AmpelopsismegalophyllaDiels et.Gilg为葡萄科蛇葡萄属植物，是湖北西部地区民间常用中草药，又称为“霉茶”，可用作茶的替代品[1]。课题组前期研究及文献报道表明大叶蛇葡萄提取物具有降血压[2]、降血糖[3]及抗病毒[4]等作用。近年来抗肿瘤药物研究愈来愈受到人们的关注，而现代研究提示大叶蛇葡萄中含有的黄酮类成分具有良好的抗肿瘤作用[5]。本文采用MTT法研究了大叶蛇葡萄3种提取物和5种单体化合物对肝癌细胞SMMC-7721增殖的抑制作用，为其资源的开发利用提供实验依据。

1 材料

1.1 药物与试剂

大叶蛇葡萄采集于湖北省恩施州来凤县，经湖北中医药大学张秀桥教授鉴定为葡萄科蛇葡萄属植物大叶蛇葡萄AmpelopsismegalophyllaDiels et.Gilg，取其叶及嫩茎为实验研究材料；DMEM培养基、胰蛋白酶、青霉素-链霉素(美国Thermo公司)；小牛血清(NBS,杭州四季青生物工程材料有限公司)；二甲基亚砜(DMSO,美国Sigma公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT，分析纯,美国 Amresco公司)。

1.2 细胞

人肝癌细胞株SMMC-7721(中国典型培养物保藏中心),采用DMEM培养基(含10%小牛血清、100 μg·mL-1青霉素-链霉素)于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养,每2～3 d传代1次，实验用细胞均处于对数生长期。

1.3 仪器

Galaxy s+CO2培养箱(英国RS Biotech公司)；IX51Olympus倒置显微镜(日本Olympus公司)；ClassⅡtype A2超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；CP114电子天平(美国Ohaus仪器有限公司)；iMark酶标仪(美国Bio-RAD公司)。

2 方法

2.1 大叶蛇葡萄提取物及单体化合物的制备

将8.5 kg大叶蛇葡萄药材粉碎，过筛后用8倍量70%乙醇水加热回流提取2次，分别为1、0.5 h，合并提取液，减压浓缩，得乙醇浸膏；浸膏用水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取至无色，分别合并萃取液，减压浓缩得石油醚萃取物部位、乙酸乙酯萃取物部位和水溶性物部位。称取乙酸乙酯部位浸膏200 g，采用硅胶柱、Sephadex LH-20柱色谱及重结晶等技术分离纯化，分别得到蛇葡萄素、杨梅素、杨梅苷、大黄素及槲皮素等单体化合物。分别精密称定上述适量提取物，DMSO配制成适当浓度的储备液，保存于4 ℃冰箱中，使用时用培养基稀释成所需的药物浓度；部位提取物的质量浓度分别设为6.25、12.5、25、50、100、200 μg·mL-1，单体化合物的浓度设为10、20、40、80、160、320 μmol·L-1。

2.2 大叶蛇葡萄对SMMC-7721细胞增殖的影响

随着科技和社会的不断发展，材料验收方式也不断得到创新，例如钢材的验收方式，由之前的理计转变为检尺和过磅相结合的方法，同时根据材料的不同，使用不同的检查仪器对材料的质量进行更深层的验收。但不可否认的是，现行的材料验收方式也存在着一些弊端。

取对数生长期的细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，以5×103个·mL-1接种于96孔板，每孔100 μL继续培养24 h，细胞贴壁后，加入不同浓度的样品溶液100 μL，每组3个复孔，空白对照组加培养基，继续培养24、48、72 h后于每孔加MTT(5 mg·mL-1)20 μL，孵育4 h，吸去上清液，每孔加入100 μL的DMSO，放置于摇床上至每孔结晶物完全溶解。酶标仪于490 nm处测量各孔的吸光度(A)值。实验重复3遍，按公式(1)计算细胞增殖抑制率。

细胞增殖抑制率(%)=[1-A实验组/A对照组]×100%

(1)

2.3 统计学处理

3 结果

3.1 大叶蛇葡萄提取物对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用

石油醚萃取物部位、乙酸乙酯萃取物部位和水溶性物部位分别对SMMC-7721细胞作用24、48、72 h 的增殖抑制作用结果见表1。当药物作用24 h后，在100～200 μg·mL-1时，乙酸乙酯萃取物部位对SMMC-7721的抑制作用具有统计学差异(P<0.05，下同)，经计算其抑制率分别为22.46%和74.62%；当药物作用48 h后，在50～200 μg·mL-1范围内，乙酸乙酯萃取物部位对SMMC-7721的抑制作用具有统计学差异，经计算其抑制率分别为9.68%、34.45%和72.52%；当药物作用72 h后，在50～200 μg·mL-1范围内，乙酸乙酯萃取物部位对SMMC-7721的抑制作用具有统计学差异，经计算其抑制率分别为11.89%、50.69%和83.37%。由以上可知，当药物质量浓度为100 μg·mL-1时，乙酸乙酯萃取物部位对SMMC-7721的抑制作用随时间的延长而增强，表现一定的时间依赖性；经计算得乙酸乙酯萃取物部位作用SMMC-7721细胞24、48、72 h的IC50分别为152.67、143.25、110.81 μg·mL-1，该部位为抑制SMMC-7721细胞增殖的活性物质部位。石油醚萃取物部位对SMMC-7721细胞有一定的抑制作用，SMMC-7721对水溶性物部位不敏感。

3.2 大叶蛇葡萄单体化合物对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用

蛇葡萄素、杨梅素、杨梅苷、大黄素和槲皮素5种单体化合物分别作用于SMMC-7721细胞24、48、72 h后，对细胞增殖抑制作用的结果见表2～4。由表2可知，当受试化合物作用24 h后，在160～320 μmol·L-1时，蛇葡萄素对细胞增殖的抑制作用具有统计学差异，经计算其抑制率分别为13.14%和24.84%；在40～320 μmol·L-1范围内，大黄素对细胞增殖的抑制作用具有统计学差异，经计算其抑制率分别为24.23%、58.69%、48.29%和73.58%。由表3可知，当受试化合物作用48 h后，在160～320 μmol·L-1时，蛇葡萄素、杨梅素和槲皮素对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用具有统计学差异，经计算蛇葡萄素的抑制率分别为21.99%和60.46%；在40～320 μmol·L-1范围内，大黄素对细胞增殖的抑制作用具有统计学差异，经计算其抑制率分别为43.27%、63.05%、58.93%和72.89%。由表4可知，当受试化合物作用72 h后，在160～320 μmol·L-1时，蛇葡萄素、杨梅素和槲皮素对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用具有统计学差异，经计算蛇葡萄素的抑制率分别为28.18%和74.78%；在10～320 μmol·L-1范围内，大黄素对细胞增殖的抑制作用具有统计学差异，经计算其抑制率分别为8.30%、8.10%、59.50%、75.84%、74.68%和82.49%。以上结果提示，当受试化合物浓度分别为160和320 μmol·L-1时，蛇葡萄素对SMMC-7721的增殖抑制作用随时间的延长而增强，表现一定的时间依赖性；经计算得蛇葡萄素作用SMMC-7721细胞48、72 h的IC50分别为277.76和248.86 μmol·mL-1；当受试化合物浓度分别为40、80、160 μmol·L-1时，大黄素对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用均随时间的延长而增强，分别表现出时间依赖性，即当受试化合物作用时间为72 h时，大黄素对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用最强；经计算得大黄素作用SMMC-7721细胞24、48、72 h的IC50分别为118.63、88.41、53.20 μmol·L-1。实验结果表明大黄素、蛇葡萄素、杨梅素及槲皮素均对SMMC-7721细胞有一定的增殖抑制作用，其中大黄素的作用最强。杨梅苷对SMMC-7721细胞无抑制作用。

质量浓度/μg·mL-1A药物作用24h药物作用48h药物作用72h石油醚萃取物部位乙酸乙酯萃取物部位水溶性物部位石油醚萃取物部位乙酸乙酯萃取物部位水溶性物部位石油醚萃取物部位乙酸乙酯萃取物部位水溶性物部位6.250.984±0.0251.011±0.0120.630±0.0551.123±0.0321.230±0.0351.195±0.0091.442±0.0361.619±0.0331.559±0.00812.50.977±0.0461.082±0.0450.923±0.0631.068±0.0821.216±0.0221.177±0.0491.475±0.0241.657±0.0311.446±0.111251.020±0.0130.994±0.0190.961±0.0331.173±0.0771.128±0.0201.240±0.0951.468±0.0151.625±0.0431.544±0.015501.045±0.0360.835±0.0060.961±0.0281.113±0.0141.054±0.021*1.219±0.0351.345±0.0081.344±0.010**1.462±0.0031000.890±0.0320.575±0.033**0.933±0.0531.293±0.1200.765±0.017**1.316±0.0381.216±0.010**0.752±0.020**1.529±0.0242000.950±0.0250.188±0.003**0.926±0.0390.748±0.011*0.321±0.019**1.315±0.0770.773±0.031**0.254±0.010**1.490±0.016细胞对照0.769±0.0400.742±0.0620.765±0.0291.157±0.0221.167±0.0131.147±0.0351.549±0.0221.525±0.0151.564±0.021

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；下同。

样品A10μmol·L-120μmol·L-140μmol·L-180μmol·L-1160μmol·L-1320μmol·L-1细胞对照蛇葡萄素1.090±0.0121.063±0.0381.134±0.0151.148±0.0070.928±0.026*0.803±0.054**1.068±0.018杨梅素1.168±0.0281.091±0.0371.062±0.0461.187±0.0271.132±0.0280.887±0.055**1.067±0.011杨梅苷1.035±0.0181.059±0.0651.094±0.0161.212±0.0221.030±0.0131.026±0.0161.066±0.093大黄素1.200±0.0261.202±0.0050.833±0.034**0.454±0.006**0.568±0.012**0.290±0.018**1.099±0.004槲皮素1.095±0.0160.964±0.0211.002±0.0381.066±0.0170.940±0.0080.976±0.0191.045±0.047

样品A10μmol·L-120μmol·L-140μmol·L-180μmol·L-1160μmol·L-1320μmol·L-1细胞对照蛇葡萄素1.445±0.0271.488±0.0071.433±0.0311.380±0.0411.094±0.015**0.554±0.014**1.402±0.014杨梅素1.435±0.0161.453±0.0071.443±0.0171.360±0.0561.159±0.043**0.941±0.010**1.401±0.007杨梅苷1.429±0.0051.510±0.0091.467±0.0141.469±0.0211.491±0.0151.122±0.004**1.400±0.002大黄素1.326±0.0281.359±0.0230.763±0.006**0.497±0.012**0.552±0.004**0.365±0.024**1.345±0.006槲皮素1.431±0.0291.440±0.0191.277±0.0071.204±0.005*1.118±0.014**0.956±0.018**1.324±0.027

样品A10μmol·L-120μmol·L-140μmol·L-180μmol·L-1160μmol·L-1320μmol·L-1细胞对照蛇葡萄素1.686±0.0151.804±0.0021.848±0.0381.743±0.0231.124±0.015**0.395±0.009**1.565±0.029杨梅素1.691±0.0221.756±0.0161.840±0.0081.767±0.0131.421±0.013**0.805±0.013**1.563±0.023杨梅苷1.616±0.0201.692±0.0091.771±0.0071.849±0.0051.946±0.0111.407±0.021**1.563±0.019大黄素1.430±0.013**1.433±0.031**0.631±0.006**0.377±0.018**0.395±0.002**0.273±0.020**1.559±0.010槲皮素1.662±0.0051.631±0.0301.658±0.0141.406±0.0251.199±0.005**0.948±0.018**1.514±0.008

4 讨论

肿瘤已成为严重威胁人类健康的疾病之一[6]，而目前治疗肿瘤的药物多为化学药，久用会产生耐药性且伴随毒副作用[7]。故从天然植物中寻找抗肿瘤药物是现代医药的发展方向[8]。

本实验研究结果表明大叶蛇葡萄中的乙酸乙酯和石油醚萃取物部位、蛇葡萄素、杨梅素、大黄素和槲皮素对SMMC-7721均有一定的增殖抑制作用，其中乙酸乙酯萃取物部位和大黄素的抑制作用较强。乙酸乙酯萃取物部位对SMMC-7721的抑制作用最高,可达83.37%，而大黄素在一定浓度时对细胞的抑制作用随着时间的延长而增强，呈现一定的时效关系。当作用72 h时，IC50为53.20 μmol·L-1。但其作用机理有待进一步研究。

综上所述，大叶蛇葡萄提取物对SMMC-7721细胞具有明显的增殖抑制作用，这为更深入地研究大叶蛇葡萄的抗肿瘤作用奠定了良好基础。

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InhibitoryEffectofAmpelopsismegalophyllaExtractsonSMMC-7721CellsProliferation

HUANGJing，GUIChun，DAGuozheng，SHANGXiangwei，MINGXiaofang，ZHANGXiuqiao*

(SchoolofPharmaceuticalSciences，HubeiUniversityofChineseMedicine，Wuhan430065，China)

Objective：To explore the inhibitory effect of leaves and tender stem extracts ofAmpelopsismegalophyllaon SMMC-7721 cells proliferation and screen the anti-tumor active ingredientsinvitro.Methods：Petroleum ether，ethyl acetate(EtOAc)and aqueous extracts ofA.megalophyllaas well as five compounds，ampelopsin，myricetin，myricetrin，emodin and quercetin were selected to treat SMMC-7712 at different concentration for 24,48,72 h through MTT assay，respectively.Results：Treatment with EtOAc extract or emodine inhibited the cell proliferation in different degrees.EtOAc extract and emodin could inhibit cell proliferation in a time-effect relationship in 100 μg·mL-1and in 40,80 and 160 μmol·L-1，respectively.IC50of EtOAc extract and emodin on SMMC-7721 cells in 72 h were 110.81 μg·mL-1and 53.20 μmol·L-1.Conclusion：Extracts ofA.megalophyllahas good anti-tumor activityinvitro.

Ampelopsismegalophylla；SMMC-7721 cells；inhibitory proliferation

国家自然科学基金项目(31170335)；湖北省自然科学基金重点项目(2014CFA083)

] 张秀桥，教授，研究方向：中药品种、质量及资源开发；E-mail：qiaoxzh2000@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.011

2016-06-22)

*[