全蝎质量评价及标准提高研究△

刘凯娜，王晓云，潘赢，程雅婷，庞静，王健，郭金颖

(河北省秦皇岛市食品药品检验中心，河北 秦皇岛 066004)

·基础研究·

全蝎质量评价及标准提高研究△

刘凯娜*，王晓云，潘赢，程雅婷，庞静，王健，郭金颖

(河北省秦皇岛市食品药品检验中心，河北 秦皇岛 066004)

目的：建立全蝎的质量控制方法用于质量评价。方法：对全蝎水分、总灰分、酸不溶性灰分进行检查；考察不同浸出物溶剂对测定结果的影响；采用TLC法对全蝎中脂类成分进行定性鉴别；采用HPLC法测定全蝎中特征氨基酸的含量。结果：拟定了水分、总灰分、酸不溶性灰分限量；浸出物测定以乙醇为溶剂更为科学；TLC色谱斑点清晰；甘氨酸、精氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸分别在0.509 1～5.091 0 μg(r=1.000 0)、0.502 5～5.025 0 μg(r=1.000 0)、0.348 2～3.482 0 μg(r=1.000 0)、0.508 8～5.088 0 μg(r=1.000 0)与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率分别为102.5%(RSD=2.7%，n=9)，104.1%(RSD=2.8%，n=9)，102.5%(RSD=2.2%，n=9)，102.3%(RSD=2.9%，n=9)。结论：本法简便、准确、重复性好，可用于全蝎的质量控制。

全蝎；检查项；浸出物；TLC；HPLC；质量评价

全蝎为钳蝎科动物东亚钳蝎ButhusmartensiiKarsch的干燥体。性平，味辛，有熄风止痉、通络止痛、攻毒散结的功能[1]143。市售品多为咸全蝎[2]。现代研究表明蝎毒为全蝎的主要活性成分[3]。

全蝎现行法定检验标准为《中华人民共和国药典》(《中国药典》)2015年版一部，包括性状、显微鉴别、浸出物、黄曲霉毒素，鉴于当前标准较简单，不足以全面反映药品质量，为了系统地评价全蝎的质量特性，本文考察了水分、总灰分、酸不溶性灰分等检查项；考察了不同浸出物溶剂对测定结果的影响；建立了全蝎的TLC鉴别方法；建立了全蝎中特征氨基酸的HPLC含量测定方法，为全蝎质量标准的提高提供依据。

1 材料

岛津LC-20A高效液相色谱仪，BHW-09恒温电加热器(成都广普科学仪器有限公司)，TG16-WS台式高速离心机(湘仪离心机仪器有限公司)，AG-135电子天平(METTLER TOLEDO，d=0.01 mg)，PHS-3C pH计(上海雷磁仪器厂)，HX113489硅胶G薄层板(MERCK，Silica gel 60)，DL-1028H超声波清洗器(BANDELIN)。

全蝎对照药材(批号：121044-200903)，对照品油酸(批号：111621-201205，纯度：99.6%)、甘氨酸(批号：140689-201103，纯度：100.0%)、精氨酸(批号：140685-201305，105 ℃干燥3 h，纯度：100.0%)、L-脯氨酸(批号：140677-200405，含量测定用)、亮氨酸(批号：140687-201102，纯度：100.0%)购于中国食品药品检定研究院，异硫氰酸苯酯(PITC)(西亚试剂，批号：201203014，含量为98%)，乙腈(MREDA，USA，色谱纯)，水为超纯水(Milli-Q)，其他试剂均为分析纯。

124批全蝎样品为河北省省级评价抽验品种，覆盖全国7个省市57家生产企业。经秦皇岛市食品药品检验中心主任药师邸立杰鉴定为钳蝎科动物东亚钳蝎ButhusmartensiiKarsch的干燥体。样品信息见表1。

表1 全蝎样品来源信息表

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

取本品1 g，剪碎，加石油醚(60～90 ℃)20 mL，超声处理20 min，滤过，滤液作为供试品溶液。另取全蝎对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再取油酸对照品，加石油醚(60～90 ℃)制成每1 mL含5 mg油酸的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部 通则0502)试验，吸取供试品和对照药材溶液各5 μL，对照品溶液2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙醚-冰醋酸(36∶9∶0.9)为展开剂，展缸预平衡20 min，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图1。124批全蝎样品斑点清晰程度各不相同。

注：S1.油酸对照品；S2.全蝎对照药材；1～10.样品。图1 全蝎TLC图谱

2.2 水分

依法测定124批样品(《中国药典》2015年版四部 通则0832第二法)，结果在6%～50%。造成水分含量高低有别的可能原因为炮制过程中干燥的程度不同，包装以及存储环境导致样品吸潮程度不同。根据测定结果，拟规定限度为不得过20.0%。

2.3 总灰分、酸不溶性灰分

依法测定124批样品(《中国药典》2015年版四部 通则2302)，总灰分最高为39%，酸不溶性灰分最高为3.5%，纯净度差别较大主要缘于含盐、含土量不同，结合性状分析可知，含盐分高者，如混有盐粒，总灰分会相对偏高。建议总灰分不得过20.0%，酸不溶性灰分不得过3.0%。

2.4 不同浸出物溶剂对测定结果的影响

现行标准浸出物所用溶剂稀乙醇(52.9%)能够溶解全蝎中的盐分，测得数据不够科学，本实验采用乙醇(95%)作溶剂，分别挑选高盐分及低盐分的样品，测定其浸出物的含量，考察不同体积分数乙醇对浸出物测定结果的影响。表2结果表明，含盐分较高的样品采用乙醇为溶剂浸出物测定结果约降低60%，低盐分样品测定结果几乎无变化。可见以乙醇为浸出物溶剂能够消除盐分的影响，且不影响有效成分的溶出。

2.5 特征氨基酸的含量测定

2.5.1色谱条件 色谱柱Wondasil C18-WR(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A为乙腈-0.1 mol·L-1醋酸钠溶液(用冰醋酸调节pH值至6.5)(7∶93)，流动相B为乙腈-水(4∶1)，梯度洗脱条件见表3；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为254 nm；柱温为40 ℃；进样量为5 μL。

表2 不同体积分数的乙醇对浸出物测定结果的影响

表3 梯度洗脱条件

2.5.2 对照品与供试品的制备

2.5.2.1 对照品溶液的制备 取甘氨酸对照品、精氨酸对照品、L-脯氨酸对照品、亮氨酸对照品适量，精密称定，加0.1 mol·L-1盐酸溶液制成每1 mL各含100 μg的混合溶液，取上述溶液5 mL，置于25 mL量瓶中，加入0.1 mol·L-1异硫氰酸苯酯(PITC)的乙腈溶液2.5 mL，1 mol·L-1三乙胺的乙腈溶液2.5 mL，摇匀，室温放置1 h后，加50%乙腈至刻度，摇匀。取10 mL，加正己烷10 mL，振摇，放置10 min，取下层溶液，滤过，取续滤液，即得。

2.5.2.2供试品溶液的制备 取全蝎样品细粉0.1 g，精密称定，加6 mol·L-1盐酸溶液5 mL，密封，150 ℃水解1 h，取出放冷至室温，精密吸取水解液1 mL，蒸干，残渣加0.1 mol·L-1盐酸溶液溶解，转移至10 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1盐酸溶液至刻度，摇匀，取上述溶液5 mL，按2.5.2.1项下方法自“置于25 mL量瓶中，加入0.1 mol·L-1异硫氰酸苯酯(PITC)的乙腈溶液2.5 mL”起操作，即得。

2.5.2.3 空白溶液的制备 取0.1 mol·L-1盐酸溶液5 mL，按2.5.2.1项下方法自“置于25 mL量瓶中，加入0.1 mol·L-1异硫氰酸苯酯(PITC)的乙腈溶液2.5 mL”起操作，即得。

2.5.3 含量测定方法验证

2.5.3.1 专属性考察 取混合对照品溶液、供试品溶液、空白溶液按上述2.5.1色谱条件测定，空白无干扰，色谱峰分离度良好，理论塔板数均大于20 000，见图2。

注：A.混合对照品；B.全蝎样品；C.空白对照品；1.甘氨酸；2.精氨酸；3.L-脯氨酸；4.亮氨酸。图2 全蝎样品和对照品HPLC图

2.5.3.2 线性关系考察 精密吸取混和对照品溶液1、2、4、8、10 μL，在2.5.1项的色谱条件下测定含量，记录色谱峰面积，以峰面积(Y)对进样量(X)进行线性回归，回归方程分别为Y甘氨酸=457 225X-6 152.76，r=1.000 0；Y精氨酸=189 815X-2 824.61，r=1.000 0；YL-脯氨酸=324 434X-2 692.74，r=1.000 0；Y亮氨酸=278 969X-3 374.43，r=1.000 0。结果显示，甘氨酸在0.509 1～5.091 0 μg、精氨酸在0.502 5～5.025 0 μg、L-脯氨酸在0.348 2～3.482 0 μg、亮氨酸在0.508 8～5.088 0 μg线性关系良好。

2.5.3.3 精密度考察 取同一混合对照品溶液，按2.5.1色谱条件连续进样6次，测得甘氨酸、精氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸色谱峰的峰面积RSD分别为0.84%、0.76%、0.65%、0.73%，表明仪器精密度良好。

2.5.3.4 重复性考察 同一份样品共取6份，按2.5.2.2项下方法平行制备供试品溶液，分别进样，记录色谱数据。结果甘氨酸、精氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸的含量RSD分别为0.78%、0.64%、0.69%、0.57%，表明该方法重现性良好。

2.5.3.5稳定性考察 取同一供试品溶液，按2.5.1项下色谱条件分别于0、4、8、12、24 h进样，记录峰面积，甘氨酸、精氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸色谱峰的峰面积RSD分别为0.84%、0.96%、1.06%、0.75%，表明供试品溶液在室温24 h内稳定。

2.5.3.6 加样回收率考察 称取约50 mg已知含量的供试品细粉9份，平行分为3组，分别加入高、中、低3个浓度对照品的盐酸溶液，再加盐酸使成5 mL，按2.5.2.2项下操作，按2.5.1色谱条件进行测定，计算加样回收率。结果甘氨酸、精氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸的加样回收率分别为102.5%、104.1%、102.5%、102.3%，RSD分别为2.7%、2.8%、2.2%、2.9%。

2.5.3.7 样品测定 取不同批次的样品0.1 g，精密称定，按2.5.2.2项下方法制备供试品溶液，并按2.5.1项下色谱条件测定含量，按干燥品计算，结果甘氨酸、精氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸的含量范围分别为2.47%～9.43%、2.06%～12.66%、1.37%～8.73%、2.42%～9.24%，4种氨基酸总和范围为8.52%～35.95%，平均值为19.28%。建议规定含氨基酸以甘氨酸、精氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸的总量计不得少于15.0%。

3 讨论

全蝎样品为我中心省级评价品种，当时执行标准为《中国药典》2010年版一部，包括性状、显微鉴别、浸出物3项，按法定标准检验，不合格率为9%，全部为浸出物不合格。2015年版《中国药典》针对咸全蝎易吸潮霉变的特点增加了黄曲霉毒素检查项，但仍然控制不了全蝎的纯净度。综观全蝎质量参差不齐，性状差异较大，干湿程度不一，含盐量相差悬殊，色泽也不一致，水分测定值高达50%，有的腹内泥土较多，有的混有明显的盐粒，这些人为增重的方法均能影响药物疗效[4]，现行标准对上述内容均无控制指标，尤其是缺少有效成分的专属性检测方法，需要不断完善。故增加水分、总灰分、酸不溶性灰分检查项是极其必要的。

上文提出浸出物所用溶剂不能消除盐分的影响，不够科学，为了进一步证实这一点，我们运用SPSS软件进行总灰分与浸出物数据的相关性分析，结果显示显著相关(P=0.000，r=0.858)。可见浸出物测定以一定的总灰分限度为前提，或者改变浸出物的溶剂，可以消除盐分影响。

全蝎的活性成分蝎毒主要由非蛋白质部分和蛋白质部分组成，非蛋白质部分主要包括一些以饱和脂肪酸为主的脂类成分，如油酸；毒性蛋白(蝎毒素)是由20～80个氨基酸残基构成的小分子蛋白质[5]。故本文建立了以油酸为对照品、全蝎为对照药材的TLC定性鉴别方法及特征氨基酸的HPLC含量测定方法。

全蝎中脂类成分的薄层色谱鉴别曾比较不同的薄层板和不同的温湿度条件，均取得较好的分离效果，该方法参照鸦胆子中油酸的TLC鉴别制定[1]254-255。全蝎中特征氨基酸的含量测定选取蝎毒蛋白的水解产物——氨基酸为含量测定对象。甘氨酸、精氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸在全蝎中的含量较高，且不易被酸氧化破坏，故本实验以这4种氨基酸为指标成分进行含量测定。提取方法、流动相的选择、柱温、检测波长、流速等均参照文献制订[6-10]。

全蝎中脂类成分的TLC鉴别及特征氨基酸的含量测定方法能够消除水、盐的影响，二者结果趋近一致，且为有效成分的专属性检测，故更能真实地反映全蝎的质量水平，可为现行标准的提高提供参考。同时建议明确规定炮制方法中沸盐水的浓度、煮制时间及干燥程度，各检测项目有机结合，从整体上评价全蝎的质量水平。

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StandardImprovementofScorpionandQualityEvaluation

LIUKaina*，WANGXiaoyun，PANYing，CHENGYating，PANGJing，WANGJian，GUOJinying

(QinhuangdaoInstituteforFoodandDrugControlofHebeiProvince，Qinhuangdao066004，China)

Objective：To establish the quality standard for scorpion used for quality evaluation.Methods：The contents of moisture，total ash and acid insoluble ash were determined.The effect of different extract solvents on the determination was investigated.Lipid components of scorpion were identified by TLC，the contents of characteristic amino acids were determined by HPLC.Results：The content of moisture，total ash and acid insoluble ash had been measured.The extract determination was more reasonable with ethanol as the solvent.The developed TLC spots were obvious.The method had good linear relationship within the range of 0.509 1-5.091 0 μg for glycine(r=1.000 0)，0.502 5-5.025 0 μg for arginine(r=1.000 0)，0.348 2-3.482 0 μg forL-proline(r=1.000 0)and 0.508 8-5.088 0 μg for leucine(r=1.000 0).The average recoveries were 102.5%，104.1%，102.5% and 102.3% with RSD of 2.7%，2.8%，2.2% and 2.9%(n=9)，respectively.Conclusion：The method is simple，accurate and specific，and can be used in the quality control of scorpion.

scorpion；check items；extract；TLC；HPLC；quality evaluation

河北省食品药品监督管理局科技计划项目(ZC2015004)

] 刘凯娜,主管中药师，研究方向：中药材检验及质量控制；E-mail:258252940@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.2.010

2016-05-24)

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