松树皮原花青素对乳腺癌细胞增殖和转移作用

杨微，贺宝霞，张斌

(郑州大学 附属肿瘤医院，河南 郑州 450008)

·基础研究·

松树皮原花青素对乳腺癌细胞增殖和转移作用

杨微*，贺宝霞，张斌

(郑州大学 附属肿瘤医院，河南 郑州 450008)

目的：研究松树皮提取物原花青素(PMBE)对人乳腺癌MCF-7细胞体外转移及侵袭作用的影响，并初步探讨其作用机制。方法：不同浓度PMBE作用于体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞，采用MTT法检测其对细胞增殖抑制作用的影响；通过划痕实验检测PMBE对细胞转移能力的影响；体外侵袭实验(Transwell小室)检测PMBE对细胞侵袭能力的影响；最后应用免疫印迹(Western-blot)方法检测PMBE对MCF-7细胞基质金属蛋白酶-9表达水平的影响。结果：随着PMBE浓度的增加，MTT法检测结果表明，PMBE在体外对MCF-7细胞有明显的增殖抑制作用，半数致死浓度(IC50)值为(71±2.1)μg·mL-1；PMBE质量浓度为5、15 μg·mL-1时，细胞划痕的闭合能力分别下降25%、36%，细胞侵袭能力下降59%、79%；PMBE能显著抑制MCF-7细胞MMP-9蛋白的表达。结论：PMBE能有效抑制乳腺癌增殖和转移，其作用机制可能与降低乳腺癌细胞运动能力有关，PMBE有潜力开发为治疗乳腺癌的药物。

马尾松树皮提取物；乳腺癌；体外侵袭实验；转移

马尾松PinusmassonianaLamb.是我国特有的树种，其树皮在民间已广泛用于治疗风湿性关节痛、炎症和癌症[1]，其主要提取成分为原花青素(PMBE)。PMBE属于多酚类化合物，具有多种生物活性，尤其是抗氧化和清除自由基的作用[2]。生物活性研究表明，PMBE通过诱导细胞凋亡对人肝癌和宫颈癌细胞产生抑制作用[3]；不仅具有良好的营养利用价值，更具有抗氧化、抗衰老、抗炎及诱导肿瘤细胞凋亡等活性[4-6]。

乳腺癌是威胁女性健康最常见的恶性肿瘤之一，易发生全身重要脏器的转移，如脑转移、肺转移、肝转移等。研究证实，乳腺癌的侵袭和转移特性是导致患者死亡的关键因素[7]。因此，探索能有效抑制乳腺癌转移和侵袭的抗肿瘤药物成为目前研究热点。已有研究发现PMBE具有抑制肿瘤转移和侵袭的作用[8-10]，然而国内针对乳腺癌的研究较少，为充分探究PMBE对乳腺癌的抑癌作用，进行以下相关研究。

1 材料

人乳腺癌MCF-7肿瘤细胞(凯基生物公司)；马尾松树皮提取物(中国陕西高新技术产业有限公司，PMBE含量≥95%)；DMEM细胞培养基(Gibco公司)；胎牛血清(TransGen公司)；双抗、胰酶(Gibco公司)；Transwell小室(康宁公司)；DMSO、结晶紫及甲醇(科密欧试剂公司)。细胞培养箱、超低温冰箱(Thermo公司)；超净台(Boxun公司)；压力蒸气灭菌器(上海博迅实业有限公司)；倒置显微镜(Novel公司)。

2 方法

2.1 细胞培养

MCF-7细胞培养于含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养液中，置于饱和湿度，37 ℃、5%二氧化碳的培养箱中培养，待细胞培养至对数生长期时，用0.25%的胰蛋白酶消化液消化，用于实验。

2.2 MTT法检测

将25 cm2细胞培养瓶中生长良好的MCF-7细胞用0.25%胰蛋白酶细胞消化液消化，制成单细胞悬液，调整细胞浓度至7×104个·mL-1，将MCF-7细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔200 μL，置37 ℃、5% 二氧化碳培养箱中培养。24 h后加药，实验组每孔加入预先以培养基稀释的不同质量浓度PMBE溶液200 μL，使PMBE终质量浓度为0、5、10、25、50、75、100 μg·mL-1，每组设置4个复孔。作用24 h后，避光条件下每孔加入5 mg·mL-1MTT 20 μL，继续培养4 h。4 h后吸弃上清液，每孔加入DMSO 150 μL，于酶标仪上检测各孔的吸光度值(A值)，测定波长为490 nm。

2.3 划痕实验检测MCF-7细胞的迁移情况

取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化吹打重悬为单细胞悬液，调至 2×105个·mL-1。将500 μL细胞悬液接种24 孔细胞培养板后过夜培养。待细胞长成单层即弃去培养液，用200 μL的枪头在24孔板每孔中央划出一道划痕，洗去死细胞后显微镜下拍照。按实验设计分细胞对照组、5 μg·mL-1组、15 μg·mL-1组，处理24 h后，在同一观察点处显微镜拍照记录细胞生长情况，实验重复3次。利用软件测量每孔多个点划痕间距，取均值，并用处理前的距离减去处理后的距离即为24 h细胞迁移距离，数据用统计软件分析。

2.4 侵袭实验

Transwell小室检测细胞转移能力，无血清培养基500 μL水化基底膜10 min，上室加入200 μL浓度为2×104个·mL-1的细胞悬液，下室分别加入500 μL药物质量浓度为0、5、15 μg·mL-1的无血清培养基，细胞培养箱孵育24 h后取出小室，放入500 μL 磷酸缓冲液(PBS)中清洗2次，500 μL甲醇中固定15 min，放入500 μL 0.1%结晶紫染色15 min，PBS清洗2次，用棉签轻擦上室内面的细胞，在40×视野下任取6个不同视野，计算细胞数目，取平均值。

2.5 Western blot试验

在MCF-7细胞培养体系中分别加入不同浓度PMBE作用48 h后，Western blot 检测MMP-9蛋白表达水平，各蛋白表达量由它们在胶片上显色后的灰度与相应β-actin 的灰度比表示。

2.6 统计分析

3 结果

3.1 PMBE对细胞增殖能力的影响

分别用0、5、10、25、50、75、100 μg·mL-1原花青素作用于乳腺癌细胞24 h后，MTT法检测细胞增殖，发现PMBE能明显抑制细胞增殖，24 h的IC50为71 μg·mL-1，差异有统计学意义(P<0.05)，且抑制作用呈浓度依赖性。5、15 μg·mL-1PMBE处理细胞后，细胞存活率分别为(84±0.05)%和(81±0.04)%，因此，在转移和侵袭实验中选用这两组浓度。见图1。

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；下同。图1 PMBE对MCF-7细胞增殖的影响

3.2 MBE对细胞迁移情况的影响

质量浓度为5、15 μg·mL-1的PMBE作用24 h后，划痕的愈合能力显著低于空白对照组(P<0.05)。5、15 μg·mL-1组使MCF-7细胞愈合能力分别降低了25%和36%，此结果表明，PMBE有抑制细胞迁移的能力。见图2。

A.MCF-7细胞被抑制0、24 h后镜下(100×)观察的细胞迁移情况；B.MCF-7细胞被抑制后划痕愈合能力量化统计结果；与0 μg·mL-1组比较，*P<0.05,**P<0.01。图2 原花青素对MCF-7细胞转移的影响

3.3 PMBE对细胞侵袭能力的影响

对照组及PMBE 5、15 μg·mL-1组穿过基底膜的细胞百分数分别为100%、41%、21%。PMBE处理组的细胞侵袭能力明显低于空白对照组(P<0.05)。 结果表明，PMBE有抑制细胞侵袭的能力。见图3。

注：A.空白组及实验组MCF-7细胞侵袭到Transwell膜下方镜下(100×)的观察结果；B.各象限细胞计数；与0 μg·mL-1组比较，**P<0.01。图3 原花青素对MCF-7细胞侵袭能力的影响

3.4 PMBE抑制MMP-9蛋白的表达

5、15 μg·mL-1原花青素药物组处理细胞48 h后，提取细胞总蛋白。Western-blot结果显示，5 μg·mL-1PMBE处理组细胞MMP-9蛋白相对于对照组细胞表达下降47%；15 μg·mL-1PMBE处理组细胞MMP-9蛋白相对于对照组细胞表达下降68%。结果表明，PMBE能显著抑制MCF-7细胞MMP-9表达变化(P<0.01，P<0.001)，减弱MCF-7细胞的侵袭能力。见图4。

注：与对照组相比，**P<0.01，***P<0.001。图4 PMBE对MCF-7细胞MMP-9蛋白表达的影响

4 讨论

研究表明，PMBE可有效抑制前列腺癌细胞的生长和增殖[11]，然而其对乳腺癌的作用罕见报道。研究首先采用 MTT方法检测PMBE对具有高侵袭性的乳腺癌细胞MCF-7生长的抑制作用，结果说明PMBE可抑制乳腺癌细胞的生长，并且具有抑制MCF-7细胞转移的作用，提示其可能具有应用于治疗乳腺癌的潜能。

转移是恶性乳腺癌最重要的生物学特征[12]，也是导致肿瘤患者死亡的主要原因之一，近年肿瘤转移机制成为研究的热点，细胞侵袭和迁移是导致肿瘤转移的必需步骤[13-14]。基底膜和细胞外基质(ECM)的生理动态平衡是防止肿瘤浸润、转移的一道天然屏障。ECM和基底膜的降解成为肿瘤细胞侵袭和转移的关键因素，其中基质金属蛋白酶家族(MMPs)起到关键作用[15]。MMP-2、MMP-9在患者胰腺癌中不同程度表达，在胰腺癌浸润和转移的过程中起着协同作用，具有促进基底膜和EMC分解的作用，有利于胰腺癌细胞的侵袭和转移[16]。研究表明多种中药提取物物都具有抑制癌细胞转移的作用，从而发挥抗癌效果，部分是通过抑制MMP-2、MMP-9的表达实现的[17]。有研究证实PMBE能够通过抑制细胞MMP-9的表达而抑制细胞转移侵袭。本实验在体外验证了PMBE能抑制乳腺癌的转移，其作用机制可能与原花青素抑制细胞中MMP-9的表达有关。

本研究采用对细胞生长影响较低的浓度观察了PMBE对乳腺癌细胞迁移能力的影响，结果显示其可抑制乳腺癌细胞的迁移能力。恶性肿瘤的转移除了与细胞迁移能力有关之外，还与细胞穿透细胞外基质的能力即侵袭能力相关。本研究采用侵袭实验观察了PMBE对乳腺癌细胞侵袭能力的影响，Western blot结果显示其可明显抑制乳腺癌细胞MMP-9的表达，从而发挥抑制肿瘤细胞转移的作用。综上所述，PMBE在体外不仅可以抑制乳腺癌细胞的迁移，还可抑制细胞的侵袭，具有抑制乳腺癌细胞增殖和转移的效果。

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Anti-metastaticEffectsofPinusmassonianaBarkExtractonBreastCancerCells

YANGWei*，HEBaoxia，ZHANGBin

(AffiliatedCancerHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450008，China)

Objective：To investigate the inhibitory effects ofPinusmassonianabark extract (PMBE) on tumor metastasis in breast cancer MCF-7 cellsinvitro.Methods：Effects of PMBE on the viability of breast cancer MCF-7 cells were detected by MTT assay.Breast cancer cell metastasis after exposure to PMBE were quantified by wound healing and Transwell assays，respectively.The expression of MMM-9 protein were evaluated by western blot.Results：Breast cancer cells after PMBPs treatment showed a dramatic reduction in cell viability in a dose-dependent manner，the IC50value of PMBP was (71±2.1) μg·mL-1.After cells were treated with 5 and 15 μg·mL-1PMBE，the cells invasion potentials were also decreased by 25% and 36%，the cell metastatic potentials were also decreased by 59% and 79%，respectively.Conclusion：Our findings indicated that PMBE had potential to develop as an anti-metastatic cancer drug for breast cancer patients.

Pinus massoniana bark extracts；breast cancer；Transwell；metastasis

] 杨微，硕士研究生，研究方向：抗肿瘤药物研究；E-mail：yangwei_0515@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.6.009

2016-10-26)

*[