磁珠核酸提取方法在血浆EBV—DNA实时荧光定量PCR检测中应用的性能评价

郑瑜宏+钟凤金+陈岩松

[摘要] 目的 评价磁珠核酸提取方法在血浆EB病毒DNA（EBV-DNA）实时荧光定量PCR检测中应用的性能。 方法 采用自动化磁珠法提取核酸，并结合实时荧光定量PCR测定EBV-DNA，利用第三方定值参考物质评价该方法的检测性能。同时选取100例鼻咽癌患者，分别用磁珠法与煮沸法定量检测其血浆EBV-DNA，比较分析两种方法的相关性。 结果 基于自动化磁珠法的实时荧光定量PCR系统检测EBV-DNA，其低、中、高水平的重复性精密度均<3/5 TEa（TEa=靶值±0.4 lg），中间精密度<4/5 TEa；在5.4×101～5.4×105 U/mL范围内具有良好的线性；最低检测限约为3.334×101 U/mL；样本中Hb干扰物浓度低于8.667 g/L，对磁珠法检测结果无明显影响。磁珠法与煮沸法的检测结果呈线性相关，阴阳性符合率为83%。 结论 采用自动化磁珠核酸提取方法结合实时荧光定量PCR检测血浆EBV-DNA，具备良好的检测性能。

[关键词] 磁珠法；EB病毒；核酸；提取；性能；血浆

[中图分类号] R446.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）08（c）-0013-05

[Abstract] Objective To evaluate the application performance of magnetic bead nucleic acid extraction method in real-time fluorescence quantitative PCR detection for plasma Epstein-Barr virus （EBV） DNA. Methods Automated magnetic bead method was used to extract nucleic acid， and combined real-time fluorescence quantitative PCR assays for quantitative EBV-DNA. The detection performance of the method was evaluated by using the third-party reference materials. In addition， 100 patients with NPC were selected， and the plasma EBV-DNA was quantitatively detected by magnetic beads method and boiling method. The correlation between the two methods was analyzed. Results In the automated magnetic bead method-based real-time fluorescence quantitative PCR detection system for EBV-DNA， the repeatability precision of the low， medium and high were all <3/5 TEa （TEa = target ± 0.4 lg）， and the intermediate precision were all < 4/5 Tea. In the range of 5.4×101 - 5.4×105 U/mL， there had good linear relationship. The minimum detection limit was about 3.334×101 U/mL. And the concentration of Hb interference in plasma was lower than 8.667 g/L， the results of magnetic bead test were not significantly affected. The detection results between magnetic bead method and boiling method were linearly related， and the qualitative coincidence rate was 83%. Conclusion The detection of plasma EBV-DNA by automated magnetic bead nucleic acid extraction method can achieve good detection performance.

[Key words] Magnetic bead method； Epstein-Barr virus； Nucleic acid； Extraction； Performance； Plasma

目前國际上普遍采用Taqman探针技术用于EB病毒DNA（Epstein-Barr virus DNA，EBV-DNA）的检测，为基础的实时荧光定量PCR法[1]，其中核酸提取纯化技术是检测的关键。现有国产试剂盒核酸提取部分大多采用煮沸法，核酸提取后无任何纯化步骤，不能有效去除干扰因素，且手工操作误差大、灵敏度低，已不能满足临床需求。近年来磁珠法逐渐成为核酸提取的新热点，具有抗干扰能力强、易于自动化、操作简便、较少核酸污染及丢失等优点。本研究计划采用自动化磁珠法提取核酸，并结合实时荧光定量PCR检测血浆EBV-DNA，参考临床实验室标准化委员会（CLSI）的EP系列文件以及中国合格评定国家认可委员会（CNAS）的《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》[2]，对该自建系统进行正确度、精密度、线性范围、最低检测限以及抗干扰能力等性能参数的评价，同时与常规的煮沸法进行方法学比对，评价该方法的临床应用价值。endprint

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血浆样本 选取2015年4月16日～2016年1月9日在福建省肿瘤医院首诊，经病理证实为鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）的患者100例，男69例，女31例，年龄11～74岁；采集患者治疗前EDTA-K2抗凝血5 mL，室温静置30 min后，3000 r/min×5 min水平离心，收集上层分装，置于-80℃保存。

1.1.2 血红蛋白溶血液 取健康体检者EDTA-K2抗凝全血5 mL，严格按照EP7-A2[3]附录F1“渗透压致溶血程序”制备血红蛋白（Hb）溶血液，经血液分析仪测定Hb浓度平均值为86.67 g/L，制备完成后立即使用。

1.1.3 第三方定值参考物质 采用“EB病毒脱氧核糖核酸（EBV DNA）液体标准物质”（国家二级），购自广州邦德盛公司，其低、中、高值含量分别为（5.0±1.8）×103、（5.1±1.1）×104、（5.4±1.0）×105 U/mL[标准文号GBW（E）090679～GBW（E）090681]，购入后置-80℃保存。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 Pre-NAT全自动核酸提取工作站产自上海PerkinElmer公司，ABI 7500实时荧光定量PCR仪产自美国Life Technology公司，XN-1000全自动血液分析仪产自日本Sysmex株式会社，Multiskan Go超微量紫外分光光度计产自美国Thermo Fisher公司，凝胶电泳系统产自美国Bio-Rad公司，JS-689D全自动凝胶成像分析系统产自上海培清公司。

1.2.2 试剂 磁珠法提取使用PerkinElmer核酸提取试剂，产自上海浩源公司（批号EA20160201）；煮沸法提取及两种方法扩增均使用EB病毒核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒，产自广州达安公司（批号2016004）。

1.3 方法

1.3.1 磁珠法 将试剂盒内各种试剂、耗材以及待检样本400 μL分别置于核酸提取工作站相应位置，按作业指导书操作，执行预设的自动核酸提取程序，最后得到60 μL洗脱液为核酸提取产物。

1.3.2 煮沸法 取待检标本400 μL，首先加入400 μL DNA沉淀剂，振荡混匀，12 000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀中加入60 μL DNA提取液，充分振荡1 min，瞬时离心数秒，100℃干浴（10±1）min后，12 000 r/min离心10 min，取上清液为核酸提取产物。

1.4 DNA质量评价

核酸提取产物中取5 μL/份，用琼脂糖凝胶电泳检测核酸片段完整性；另取2 μL/份用超微量紫外分光光度计测定A260与A280，计算A260/A280，比值在1.8～2.0范围确认纯度符合要求。

1.5 实时荧光定量PCR法检测EBV-DNA

将提取产物取4 μL/份，加入达安试剂盒内单管单人份PCR反应管，低速离心后，移至核酸扩增区。用核酸扩增仪进行实时荧光定量分析，PCR反应条件、参数设定按试剂盒说明书进行。通过试剂盒自带标准品建立定值标准曲线并计算样品浓度值。

1.6 质量控制

每次实验均做室内质控，将达安试剂盒的3个水平阳性质控品及阴性质控品共同视为待检样本，参与核酸上样及检测。要求在同一实验中4水平质控结果均在控，实验数据才能采用；否则该次实验无效，需重新进行。

1.7 磁珠法性能评价

1.7.1 正确度与精密度 取低、中、高3个水平定值参考物，用磁珠法提取并检测EBV-DNA，连测5 d，每天为一批，每批每个水平重复测3次，根据15个数据计算平均值，评估实测均值与理论值的偏倚（△lg），以及测定的重复性精密度（CVr，%）和中间精密度（CVi，%）。参照CNAS-CL36附录A.2中对自建检测系统不精密度的要求：以靶值±0.41 g作为允许总误差（TEa），重复性精密度<3/5TEa、中间精密度<4/5TEa，表示可接受。

1.7.2 最低检测限 取低水平定值参考物，用阴性质控品分别稀释至5.00×102、2.50×102、1.25×102、6.25×101、3.13×101、1.56×101、7.81×100 U/mL 7个浓度，每天每个浓度重复测2次，连续测3 d。以荧光曲线出现S型对数增长判为阳性，曲线无增长或者不呈S型判为阴性。根据EP17-A2[4]中关于建立检测限（LoD）的概率单位（Probit）法：先计算每个浓度的阳性检出率，利用SPSS软件进行Probit回归，当模型拟合可接受时，再通过曲线查找0.95阳性检出率下的分析物浓度，以该值作为该方法的LoD。

1.7.3 线性范围 取高水平定值参考物和阴性质控品按比例精确配制成5.4×105、5.4×104、5.4×103、5.4×102、5.4×101由高到低5个浓度的待测样品，每份样品重复测3次取平均值。根据EP6-A[5]线性评价方法：设定重复性允许误差为7.5%，目测没有明显离群值，不精密度符合要求后，使用SPSS软件进行多项式回归，并判断最适多项式，当存在非线性时，以各水平浓度的线性偏差（DL）小于线性允许误差（10%）为可接受标准。

1.7.4 抗血红蛋白干扰能力 先將Hb溶血液与阴性质控品按比例混合，配制成Hb浓度分别为0（对照）、21.67、43.33、65.00、86.67 g/L 5份干扰液。再取低、中、高3个水平定值参考物各360 μL，分别与40 μL不同浓度的干扰液进行混合，形成不同分析物浓度、不同干扰物浓度的待测样本15份。每份样品重复测3次取平均值，计算测量偏倚（%）=（干扰样本测定值-对照测定值）/对照测定值×100%。参照CNAS-CL36附录A.6中对抑制物的判断标准：以测量偏倚小于±7.5%，表示未被干扰。endprint

1.7.5 方法学比对 取前述100例NPC首诊患者的治疗前血浆，分别采用磁珠法和煮沸法平行提取并检测EBV-DNA，比较两种方法检测的阴阳性符合率、相关性等。

1.8 统计学方法

所有测定的EBV-DNA浓度（U/mL）均经对数转化为相应lg值后参与统计。采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，线性范围采用曲线拟合多项式回归分析，最低检测限采用Probit回归分析，两两相关性采用Pearson相关性分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 磁珠法性能评价结果

使用第三方定值参考物质对达安试剂盒工作标准曲线进行校准后，得到最适换算结果约为1 copies/mL=0.1 U/mL。

2.1.1 正确度与精密度 如表1～2所示，在低、中、高3个水平，磁珠法的检测偏倚均小于允许总误差，重复性精密度、中间精密度均符合要求，提示该法的正确度、不精密度均可接受。

2.1.2 最低检测限 磁珠法在不同理论病毒载量下的阳性检出率见表3。Probit回归分析显示，模型拟合可接受，最低检测限在约3.334×101 U/mL。

2.1.3 线性范围 各水平数据纳入统计后，测量不精密度均未超出允许误差范围（7.5%）。由P（bmax）均>0.05可知，数据符合统计学线性。因此，磁珠法线性范围为5.4×101～5.4×105 U/mL。见表4。

2.1.4 抗血红蛋白干扰能力 由表5可知，血浆样本中Hb干扰物的浓度低于8.667 g/L时，对3个水平定值参考物的检测偏倚均小于±7.5%，表示检测结果未被明显干扰。

2.2 方法学比对结果

两种方法检测结果均阳性的样本有78例，均阴性的样本有5例，不符合的有17例，阴阳性符合率为83%。将两组检测结果做相关分析，可知二者呈线性相关，回归方程为Y=0.324X+2.593，相关系数为R2=0.420，P=0.000。见图1。

3 讨论

近年来，随着临床对EBV-DNA检测指标重视程度的逐渐提高，国内开展EBV-DNA检测的临床实验室数量越来越多，然而由于我国现有EBV-DNA试剂盒检测结果不尽如人意，使得多数实验室转而采用自建方法进行检测。CAP和ISO15189等认可体系都强调：新的检测方法在应用到患者临床诊断之前必须进行方法学验证，以了解该检测的临床表现，保证实验结果可信度[6-10]。但目前在国内血浆EBV-DNA的临床检测方面，关于各类方法的性能评价与验证的相关报道还较为少见[11]。

本研究对自建的基于自动化磁珠法的血浆EBV-DNA实时荧光定量PCR检测系统进行了方法学的性能评价，结果显示：该方法的正确度、精密度均满足CNAS-CL36的要求，且3个水平浓度的CVi都较小，体现出自动化系统操作稳定的特点；该方法在5.4×101～5.4×105 U/mL范围内呈良好线性，最低检测限在约3.334×101 U/mL，检测灵敏度较高；抗干扰能力较强；而且该方法与煮沸法的检测结果呈线性相关，阴阳性符合率达83%。提示该方法在临床检测过程中的分析性能稳定、准确、可追溯，可以保证检测结果的有效性。

进入21世纪以来，随着高分子材料学的发展，病毒核酸的分离与提取技术不断进步[12]。相较传统的液相抽提方法，煮沸法的提取效率有所提高，但由于不能有效去除干扰物质、提取的核酸含量较低、接近临界值标本的提取结果不稳定等原因，煮沸法在临床检测中容易产生假阴性[13]。而磁珠法相比煮沸法的抗干扰能力更强，因为磁珠能够高效吸附核酸，然后通过洗涤等步骤能有效去除样本中的干扰物质[14]，极大地提高了试剂盒的灵敏度，降低了假阴性率。同时，煮沸法一般多采用手工提取，存在操作误差大、结果可重复性差、容易造成交叉污染、人员工作时间长、生物安全风险大等问题。而磁珠法可以用自动化仪器进行核酸模板的提取与上样，有效降低了手工操作带来的污染及误差，显著提高了实验效率，节约了劳动力成本。因此，自动化磁珠核酸提取系统必将成为今后实验室核酸提取的一种趋势。

由于目前国内血浆EBV-DNA检测项目还没有相应正式的实验室间比对活动，各试剂生产厂商所用工作标准品均为自主定值所得，导致不同试剂盒的检测结果间可能存在较大偏差。本研究采用了可以溯源到SI单位的标准物质对测量系统进行校准以及真实性验证，显著提高了检测结果的准确性和可比性，并有效保证了检测的质量[15]。若我国相关部门能及早建立统一的室间质控品，對促进EBV-DNA检测项目的准确化、标准化，满足实验室认可提出的溯源性要求，以及推进实验室间检验结果的互认都将具有重要意义[16]。

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（收稿日期：2017-05-19 本文编辑：程 铭）endprint