微刺激全胚胎冷冻方案在高龄患者中的应用

孔娜，刘景瑜，陈华，王玢

(南京大学医学院附属鼓楼医院生殖医学中心，南京 210009)

微刺激全胚胎冷冻方案在高龄患者中的应用

孔娜，刘景瑜，陈华，王玢*

(南京大学医学院附属鼓楼医院生殖医学中心，南京 210009)

目的探讨微刺激全胚胎冷冻方案在高龄患者中的应用价值。方法对542例年龄≥38岁、应用微刺激方案行IVF/ICSI-FET的1 020个周期进行回顾性分析，根据患者年龄分为3组：A组(38～<40岁)；B组(40～<43岁)；C组(≥43岁)，比较3组间月经第3天FSH、Gn总量、Gn天数、平均获卵数、成熟卵母细胞总数、胚胎形成数、胚胎冷冻数以及妊娠结局。结果1 020个刺激周期中119个周期因卵巢反应不良放弃周期，周期取消率11.67%；1 001个取卵周期中69个周期获卵失败，平均获卵率93.11%。932个周期获得卵母细胞，平均获卵数(1.98±1.40)个，共565个周期有胚胎冷冻，胚胎冷冻率60.62%。3组比较HCG日卵泡数、获卵数无显著性差异(P>0.05)，月经第3天FSH水平、Gn天数、成熟卵母细胞数、胚胎形成数、胚胎冷冻数组间有显著性差异(P<0.05)，其中B组的Gn天数、Gn总量、成熟卵母细胞数、胚胎冷冻数显著高于C组(P<0.05)，C组的成熟卵母细胞数、胚胎冷冻数显著低于其他两组(P<0.05)。342人共行585个移植周期，移植周期的妊娠率为20.00%，移植周期的累积妊娠率为34.21%，起始周期的累积妊娠率为21.59%。3组中随着年龄的增加，妊娠率逐渐下降(P<0.05)。结论高龄患者使用微刺激全胚冷冻方案可以获得相对满意的妊娠结局，不失为临床上的一个选择。但针对高龄患者如何根据年龄、卵巢储备功能和前次促排卵治疗结果制定适宜的治疗方案，有待于进一步的随机对照试验探讨。

微刺激方案； 高龄； 体外受精-胚胎移植

(JReprodMed2017，26(9)：880-884)

职业女性逐渐推迟生育年龄以及全面二孩政策的放开，越来越多的高龄夫妇寻求辅助生育治疗，对于高龄的患者如何选择合适的促排卵方案获得优质卵母细胞是临床医生关注的焦点问题。一方面，随着年龄的增加，卵巢储备功能及卵母细胞质量明显下降，辅助生育技术的成功率明显下降。Cui等[1]研究表明中国女性的卵巢储备功能高峰为18岁，25岁开始出现逐年下降，43岁开始出现急剧减少，50岁基本耗竭。欧洲人类生殖及胚胎学会(ESHRE)的数据显示：40岁以上患者行辅助生育技术临床妊娠率仅为15%，活产率仅10%[2]。另一方面，随着年龄增加，促排卵的风险及高龄孕产所带来的风险也明显增加。英国一项队列研究表明高龄产妇妊娠期糖尿病、剖宫产率及ICU入住率均明显增高[3]。高龄患者因卵巢储备功能下降常规刺激方案需要更大剂量的Gn，这可能进一步增加有丝分裂错误从而导致胚胎染色体的嵌合率增加[4]。微刺激方案因简便、疗程短、刺激轻微等优点近年来广泛应用于高龄不孕患者，本文总结2013年1月至2015年12月于我中心行微刺激方案促排卵、年龄≥38岁的患者的临床资料，分析该类型患者行微刺激方案的助孕结果。

资料与方法

一、研究对象及分组

收集 2013年1月至2015年12月期间在我中心采用微刺激全胚胎冷冻方案助孕、年龄≥38岁的542例患者为研究对象，共1 020个周期。排除双方染色体异常、女方生殖器异常、子宫腺肌症及子宫肌瘤。

根据患者年龄分为3组：A组(38～<40岁)204例，B组(40～<43岁)164例，C组(≥43岁)174例。

二、研究方法

1.促排卵方案：月经第3日给予枸橼酸氯米芬胶囊(CC，法地兰，高特制药，塞浦路斯)50 mg/d，5 d后阴道B超观察卵泡大小、数目及子宫内膜情况，月经第5天开始每日给予尿促性腺素(HMG，乐保得，珠海丽珠制药)75 U，B超检查以及激素水平监测，当卵泡直径达到18 mm时，给予注射用HCG(雪兰诺，瑞士)5 000 U，36 h后取卵。

2.授精、胚胎质量评估：根据病情选择常规IVF或ICSI，根据卵裂球形态与大小、核碎片量及分布、胞质均质情况等进行胚胎评分，将优质胚胎进行玻璃化冷冻。

3.胚胎移植：取卵术后2～3个月择期安排冷冻周期移植，自然周期或替代周期准备内膜，排卵后或常规孕激素转化后行冻融胚胎移植(FET)。移植术后常规黄体支持。移植术后14 d行尿妊娠试验，确定生化妊娠；移植后第28天，经B超检查见宫腔内有妊娠囊者为临床妊娠。

三、统计学分析

采用SPSS 22.0软件包对资料进行统计学处理。计量资料采用方差分析，非正态分布资料采用秩和检验；计数资料以率(%)表示，如受精率、优质胚胎率、胚胎种植率、临床妊娠率、流产率等，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、患者一般资料比较

共收集到542例患者的资料，平均年龄(41.37±2.42)岁(38～47岁)，平均不孕年限(6.76±5.41)年(5～23年)，基础FSH水平(10.95±5.15)U/L，平均基础窦卵泡数(3.86±3.47)个，体重指数(BMI)(23.18±2.94)kg/m2。其中原发不孕占22.87%(124/542)，继发不孕占77.13%(418/542)；396人为首次助孕选择微刺激方案，146人为常规助孕方案失败后改行微刺激方案。3组间一般资料比较，基础窦卵泡数、FSH水平、BMI、原发不孕比例无显著性差异(P>0.05)；A组再次助孕选择微刺激方案比例为50.00%，显著高于其它两组(P<0.05)(表1)。

表1 各组患者一般资料比较 [(-±s)，n (%)]

注：与B、C组比较，*P<0.05

二、微刺激周期基本情况比较

542例患者共行1 020个刺激周期，其中119个周期因卵巢反应不良放弃周期，周期取消率11.67%；1 001个取卵周期中69个周期获卵失败，平均获卵率93.11%。932个周期获得卵母细胞，平均获卵数(1.98±1.40)个；共565个周期有胚胎冷冻，胚胎冷冻率60.62%。3组比较HCG日卵泡数、获卵数无显著性差异(P>0.05)，月经第3天FSH水平、Gn天数、成熟卵母细胞数、胚胎形成数、胚胎冷冻数组间有显著性差异(P<0.05)，其中B组的Gn天数、Gn总量、成熟卵母细胞数、胚胎冷冻数显著高于C组(P<0.05)，C组的成熟卵母细胞数、胚胎冷冻数显著低于其他两组(P<0.05)(表2)。

表2 各组微刺激周期基本情况比较(-±s)

注：与C组比较，*P<0.05；与A组比较，#P<0.05

三、各组移植周期妊娠结局比较

共有565个周期有胚胎冷冻。至2016年6月共有342人行585个移植周期，临床妊娠率20.00%，移植周期累积妊娠率34.21%，起始周期累积妊娠率21.59%。因患者移植时可能存在年龄增长，年龄分组仍按取卵周期的年龄计算累计妊娠率。B组平均需要1.38个周期获得可移植胚胎(平均取卵周期数=取卵周期数/移植周期数)，该组患者中68.90%(113/164)有胚胎移植，移植周期的临床妊娠率及累积妊娠率随着年龄增加逐渐下降，早期流产率随年龄增加逐渐升高(P<0.05，表3)。

表3 各组移植周期妊娠结局比较(%)

注：与C组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05

讨 论

随着生育年龄的不断推迟，以及二孩政策调整，越来越多的高龄患者寻求辅助生育技术帮助。目前临床上对于高龄的定义没有统一标准，中国低反应专家共识中以40岁为高龄[5]，而在临床工作以及一些研究报告中也有以超过35或38岁为界限来定义高龄[6-7]。一般认为38岁以上女性的卵巢储备功能明显下降[8]，因此本研究总结年龄≥38岁患者行IVF/ICSI治疗妊娠结局，并根据年龄不同将其分为38～<40、40～<43、≥43岁3个组，比较各组基础FSH、基础窦卵泡数、BMI、不孕症类型等。38～<40组患者中因常规方案卵巢反应不良放弃周期或移植后未孕改为微刺激方案的患者比例(50.00%)显著高于40～<43岁组(21.95%)和≥43岁(4.60%)，分析其原因可能是由于我中心对于40岁首次助孕者选择微刺激方案的比例明显增高。2015年中国辅助生殖促排卵药物治疗专家共识提出：高龄患者常规促排卵方案失败后再考虑行微刺激方案，而极低反应患者可直接行微刺激方案或自然周期[9]。

高龄患者中卵巢低反应的发生率高达50%，如何在较短的时间内应用有效安全的方法使其获得成功妊娠，缩短到达妊娠时间TTP(time to pregnancy)[10]时间，是临床医生关注的焦点。高龄女性促排卵方案的选择比较多，根据高龄女性卵巢储备的不同，通常有长方案、拮抗剂方案、改良超长方案等。更多的学者认为，高龄女性卵巢反应不良，使用微刺激方案可以减轻患者的痛苦、减少Gn用量和医疗费用[11-13]。我们的数据显示不同年龄组在Gn天数、成熟卵母细胞数、胚胎形成数及胚胎冷冻数上存在差异。其中43岁以上患者的Gn天数明显缩短，40～<43岁组患者的成熟卵母细胞数、胚胎形成数、胚胎冷冻数显著高于43岁以上患者，与38～<40岁患者相比虽然没有统计学差异，但绝对值略高，其不按照年龄变化逐渐下降的原因可能是由于40～<43岁组患者基本情况的差异，38～<40岁患者行微刺激方案的原因中首次助孕选择非微刺激方案失败后再次助孕选择微刺激的患者比例明显高于40～<43岁组，而40～<43岁组患者首次助孕选择微刺激方案的比例升高，对于单纯因年龄因素行微刺激方案的患者，卵巢反应尚可，故可以获得较高的成熟卵母细胞数以及胚胎冷冻数。

既往研究多集中于每周期的妊娠率，但对于多次失败的患者，继续治疗的妊娠概率是这类患者实际关心的问题，对于患者而言，累积妊娠率更有意义[14]。有研究表明一般患者的妊娠多发生于前3次治疗中，第4次治疗开始其助孕成功概率明显下降[15]。本研究结果中高龄患者行微刺激方案的起始周期妊娠率为21.59%、移植周期的累积妊娠率34.21%。平均需要1.71个周期获得可移植的胚胎，同时需要平均1.74个移植周期达到妊娠。Bodri等[16]总结了3年微刺激方案的累积出生率，对于不同年龄而言，38～<40岁、40～<43岁、≥43岁患者累积出生率分别为45%、19%、5%，与本研究结果相似。随着年龄的增加，临床妊娠率、移植周期的累积妊娠率以及起始周期的累积妊娠率明显下降，这可能是由于随着年龄的增加卵母细胞质量明显下降从而造成胚胎质量随之下降的原因。40～<43岁组从取卵到移植需要的平均周期为1.38，显著小于38～<40岁的1.75和≥43岁的2.16(P<0.05)，提示该组患者具有更高的获卵数和胚胎形成数，其需要较少的重复刺激周期就可以进行移植，这可能与该组患者人群分布存在差异有关，也是本文的局限之处。今后对于该类患者助孕方案研究可以行亚群分析，需考虑医生选择方案时的倾向问题。本中心对于38～<40岁患者若根据卵巢储备功能评估认为情况尚可后，一般行常规方案助孕；若发生卵巢反应不良或无优质胚胎获得，再次助孕时考虑患者因素可能选择微刺激方案；对于该部分患者已发生卵巢反应不良，提示该部分人群非常规38～<40岁的人群，故本研究结果中该组患者获卵数及优质胚胎数小于40～<43岁组。

综上所述，对于高龄患者使用微刺激全胚胎冷冻方案可以获得相对满意的妊娠结局，从卫生经济学角度，不失为一个好的选择方案。但针对高龄患者如何根据年龄、卵巢储备功能和前次促排卵治疗结果制定适宜的治疗方案，缩短TTP，有待于进一步的随机对照试验探讨。

[1] Cui L，Qin Y，Gao X，et al.Antimüllerian hormone：correlation with age and androgenic and metabolic factors in women from birth to postmenopause[J].Fertil Steril，2016，105：481-485.

[2] Ferraretti AP，Goossens V，De Mouzon J，et al.Assisted reproductive technology in Europe，2008：results generated from European registers by ESHRE[J].Hum Reprod，2012，27：2571-2584.

[3] Fitzpatrick KE，Tuffnell D，Kurinczuk JJ，et al.Pregnancy at very advanced maternal age：a UK population-based cohort study[J].BJOG，2017，124：1097-1106.

[4] Reed BG，Babayev SN，Bukulmez O.Shifting paradigms in diminished ovarian reserve and advanced reproductive age in assisted reproduction：customization instead of conformity[J].Semin Reprod Med，2015，33：169-178.

[5] 武学清，孔蕊，田莉，等.卵巢低反应专家共识[J].生殖与避孕，2015，35：71-79.

[6] 白小双，张娜，甄秀丽，等.体外受精-胚胎移植中卵丘颗粒细胞mtDNA4977bp缺失的研究[J].中国优生与遗传杂志，2015，10：108-109.

[7] 丁锦丽，杨菁，李风和.移植胚胎数量和辅助孵化对高龄不孕症患者助孕临床结局的影响[J].生殖医学杂志，2016，25：16-21.

[8] 曹云霞.高龄女性生育力的变化与评估[J].中国计划生育和妇产科，2014，8：8-12.

[9] 乔杰，马彩虹，刘嘉茵，等.辅助生殖促排卵药物治疗专家共识[J].生殖与避孕，2015，35：211-223.

[10] Crawford NM，Steiner AZ.Age-related infertility[J].Obstet Gynecol Clin North Am，2015，42：15-25.

[11] 曹蓓，李艳萍，刘冬娥，等.微刺激方案与常规促排卵方案在高龄卵巢低反应不育女性中的前后周期比较[J].生殖医学杂志，2014，23：709-713.

[12] Youssef MA，van Wely M，Al-Inany H，et al.A mild ovarian stimulation strategy in women with poor ovarian reserve undergoing IVF：a multicenter randomized non-inferiority trial[J].Hum Reprod，2017，32：112-118.

[13] Revelli A，Chiadò A，Dalmasso P，et al.“Mild” vs.“long” protocol for controlled ovarian hyperstimulation in patients with expected poor ovarian responsiveness undergoing in vitro fertilization (IVF)：a large prospective randomized trial[J].J Assist Reprod Genet，2014，31：809-815.

[14] Malizia BA，Dodge LE，Penzias AS，et al.The cumulative probability of liveborn multiples after in vitro fertilization：a cohort study of more than 10，000 women[J].Fertil Steril，2013，99：393-399.

[15] Luke B，Brown MB，Wantman E，et al.Cumulative birth rates with linked assisted reproductive technology cycles[J].N Engl J Med，2012，366：2483-2491.

[16] Bodri D，Kawachiya S，De Brucker M，et al.Cumulative success rates following mild IVF in unselected infertile patients：a 3-year，single-centre cohort study[J/OL].Reprod Biomed Online，2014，28：572-581.

[编辑：郭永]

Applicationofmildstimulationinwholeembryofrozencycleinelderlypatients

KONG Na，LIU Jing-yu，CHEN Hua，WANG Bin*

TheAffiliatedDrumTowerHospitalofNanjingUniversityMedicalSchool，Nanjing210009

Objective： To investigate the application value of mild stimulation protocol in elderly patients.

Methods： A total of 542 patients aged≥38 years undergone 1 020 cycles with mild stimulation mild stimulation and whole embryo frozen protocol in IVF/ICSI were retrospectively analyzed.The patients were divided into 3 groups according to the age：group A (38-39 years)，group B (40-42 years)，and group C (≥43 years).The FSH levels on the third day of the menstrual cycle，dosage of gonadotropin (Gn) used，Gn days，average number of oocytes retrieved，number of mature oocytes，number of embryos，number of frozen embryos and pregnancy outcome were compared among the three groups.

Results： One hundred and nineteen cycles in 1 020 stimulation cycle were abandoned due to poor ovarian response，and the cycle cancellation rate was 11.67%.The oocytes retrieval of sixty nine cycles in 1 001 cycles was failure，and the oocytes retrieval rate was 93.11%.The oocytes retrieval of 932 cycles was successful，and the average number of oocytes retrieved was (1.98±1.40).A total of 565 cycles got frozen embryos，and the embryo frozen rate was 60.62%.The average number of oocytes retrieved and the number of frozen embryos in B group were significantly higher than those in group C (P<0.05).There was no significant difference in the number of oocytes retrieved (P>0.05)，but the FSH level on 3ndof menstrual cycle，Gn used days，number of mature oocytes，number of formed embryos & frozen embryo were significantly different among the three groups (P<0.05).Among them，Gn used days，total doses of Gn used，number of mature oocytes，and number of frozen embryos in group B were significantly higher than those in group C (P<0.05).The number of mature oocytes and number of frozen embryos in group C was significantly less than those in the other two groups (P<0.05).A total of 585 transplant cycles were performed in 342 patients，the pregnancy rate per transplantation cycle was 20.00%，and the cumulative pregnancy rate of the transfer cycle was 34.21%.The cumulative pregnancy rate of initial cycle was 21.59%.The pregnancy rate was significantly decreased with the increase of age (P<0.05).

Conclusions： Elderly patients with mild stimulation and whole embryo frozen protocol can get relatively satisfactory pregnancy outcome，and it is a good choice.How to develop appropriate treatment protocol based on age，ovarian reserve function，and previous ovulation outcomes for the elder patients should be explored in further randomized controlled trials.

Mild stimulation protocol； Elderly age； In vitro fertilization and embryo transfer

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.09.006

2017-03-11；

2017-06-21

国家自然科学基金青年科学基金项目(81601246)

孔娜，女，江苏靖江人，博士研究生，主治医师，生殖医学专业.(*

)