体外受精-胚胎移植中与生化妊娠相关因素的分析

龚衍，赵梓琳，刘伟信，曾玖芝，叶飞，赖薇

(四川省妇幼保健院生殖医学中心，成都 610045)

体外受精-胚胎移植中与生化妊娠相关因素的分析

龚衍*，赵梓琳，刘伟信，曾玖芝，叶飞，赖薇

(四川省妇幼保健院生殖医学中心，成都 610045)

目的分析体外受精-胚胎移植(IVF-ET)中导致生化妊娠的相关因素。方法回顾性分析2014年1月至2016年12月在我院行IVF/ICSI-ET助孕后生化妊娠的68个周期，以同期正常宫内妊娠的307个周期为对照组，比较两组患者的一般情况及助孕相关指标，采用Logistic回归分析筛选生化妊娠的影响因素。结果两组患者的一般情况及助孕相关指标均无显著性差异(P>0.05)。多因素Logistic回归分析发现女方年龄、亚临床甲状腺功能减退(SCH)及受精方式是生化妊娠的影响因素(P<0.05)，且年龄偏大、合并SCH未治疗或治疗后仍不正常、ICSI操作的患者更易发生生化妊娠。结论开始IVF-ET治疗前应重视甲状腺功能检查，及时纠正SCH，严格掌握ICSI指征及规范操作，重视高龄女性患者，尽量改善其卵母细胞质量等有助于降低临床上生化妊娠发生率。

体外受精-胚胎移植； 生化妊娠； 年龄； 亚临床甲减； 卵胞浆内单精子显微注射

(JReprodMed2017，26(9)：896-901)

体外受精-胚胎移植技术(IVF-ET)在临床开展接近40年，卵胞浆内单精子注射(ICSI)作为常规IVF的衍生技术，适用于严重男性因素不孕及常规IVF受精失败的患者，在临床开展也近30年，IVF/ICSI妊娠率逐渐提高，但仍徘徊在50%左右，其中部分为生化妊娠[1]。生化妊娠指胚胎已经着床，但由于某种原因妊娠终止，β-HCG只是一过性升高[2]。生化妊娠在IVF/ICSI中的发生率约为12%～30%[3]，导致助孕失败，增加患者的经济负担和心理压力，迄今为止，其发生机制尚不清楚。本研究回顾性分析我院近3年发生的68例生化妊娠的临床资料，旨在探讨其发生的相关因素，为临床中采取针对性措施提供参考，最终改善IVF/ICSI的助孕结局。

资料与方法

一、研究对象和分组

回顾性分析2014年1月至2016年12月在我院生殖医学中心行IVF/ICSI-ET助孕治疗患者的临床资料。纳入新鲜胚胎移植后生化妊娠和临床妊娠的周期，排除合并子宫畸形、子宫内膜异位症、夫妇至少一方染色体异常的周期，共纳入429个周期，其中生化妊娠68个周期，临床妊娠361个周期，生化妊娠发生率为15.85%(68/429)。临床妊娠中正常宫内妊娠307个周期，以正常宫内妊娠者为对照组。

生化妊娠诊断标准为：β-HCG超过参考值但升高不明显或下降，或移植后28 d阴道B超未见孕囊[4]。正常宫内妊娠诊断标准：移植后28 d阴道B超见子宫内孕囊、胚芽及胎心搏动。

二、研究方法

1.控制性超排卵方案：根据患者年龄、卵巢储备功能等选择促排卵方案，卵巢储备功能正常患者一般采用促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)长方案；卵巢储备功能下降、多囊卵巢综合征患者一般采用GnRH拮抗剂(GnRH-ant)方案。给予果纳芬(默克雪兰诺，德国)150～225 U启动，根据卵泡生长、激素水平情况调整促性腺激素(Gn)的种类及用量。当1～2个卵泡直径达到18 mm后注射艾泽(默克雪兰诺，德国)250 μg，36.5 h后B超引导下取卵。

2.IVF、胚胎培养：取卵后短时授精或ICSI授精，取卵后2.5～7.5 h拆除颗粒细胞以观察卵母细胞形态并评估其成熟度。将胞质颗粒细小、分布均匀，无发黑，胞浆内无坏死区、空泡、折光小体、滑面内质网等内容物，第一极体光滑、完整，呈圆形或椭圆形，透明带及卵周隙正常的MⅡ卵定义为正常形态卵母细胞，反之为异常形态卵母细胞[5]。1个周期的卵母细胞中只要有1个卵母细胞形态明显异常即定义为卵母细胞形态异常周期。

受精后20～22 h观察受精情况，双原核(2PN)为正常受精。受精后第2、3天观察卵裂、胚胎情况。根据形态学参数将第3天(D3)胚胎分为4级。Ⅰ级：卵裂球大小均匀，形态规则，透明带完整，胞质均匀清晰，没有颗粒现象，碎片0～5%；Ⅱ级：卵裂球大小略不均匀，形态略不规则，胞质可有颗粒现象，碎片10%～20%；Ⅲ级：细胞大小明显不均匀，形态明显不规则，胞质见颗粒现象，碎片21%～50%；IV级：细胞大小严重不均匀，胞质可有严重颗粒现象，碎片>50%。优质胚胎定义：Ⅰ、Ⅱ级，卵裂球>6个。Ⅰ～Ⅲ级胚胎为可移植胚胎。优胚率=优质胚胎数/可移植胚胎数×100%。移植胚胎中至少有1个优胚的周期为有优质胚胎的周期。

3.ET、黄体支持及随访：取卵后3 d腹部超声引导下移植1～3个胚胎。取卵日肌肉注射黄体酮(浙江仙琚)60 mg/d进行黄体支持，胚胎移植日口服地屈孕酮(上海雅培)20 mg/d。移植后14 d查血清β-HCG，确诊生化妊娠者移植28 d行B超检查。

4.观察指标：统计每个周期的一般情况：双方年龄、不孕因素、女方体重指数(BMI)、自然流产史、是否合并亚临床甲状腺功能减退(SCH)、男方精子DNA碎片率。统计IVF过程中：HCG日孕酮(P)水平、卵母细胞形态、受精方式、优胚率、移植胚胎数、移植胚胎中是否有优胚、子宫内膜厚度等。

男方IVF前常规按照WHO第五版精液分析标准进行精液检查，精子DNA碎片率>15%为升高。女方IVF术前常规检查甲状腺功能，如异常即给予相应治疗。SCH的诊断标准：参考美国甲状腺学会推荐的妊娠早期诊断标准，促甲状腺激素(TSH)>2.5 mU/L，游离甲状腺素(FT4)、游离三碘甲腺原氨酸(FT3)正常。治疗：口服左甲状腺素钠片(柏林，德国)，将TSH控制在2.5 mU/L以下[6]。ET后首次验孕日查甲状腺功能，如TSH<2.5 mU/L为治疗后正常，否则为治疗后仍不正常，未遵医嘱服药者为未治疗。HCG日P值<9.51 nmol/L为正常；如HCG日P≥9.51 nmol/L或≥4.76 nmol/L持续超过3 d，HCG日内膜<8 mm则取消移植，全胚冷冻。

三、统计学方法

结 果

一、一般情况比较

生化妊娠组68个周期，女方年龄22～45岁，男方年龄23～58岁；正常宫内孕组307个周期，女方年龄20～43岁，男方年龄24～46岁。两组患者一般情况比较无显著性差异(P>0.05)(表1)。

二、助孕相关指标比较

生化妊娠组移植日内膜厚度为8～18 mm，卵母细胞形态异常的周期1个；正常宫内孕组移植日内膜厚度为6～20 mm，卵母细胞形态异常的周期2个。两组患者助孕治疗中相关指标比较无显著性差异(P>0.05)(表2)。

三、单因素Logistic回归分析

以组别为结果变量，其余变量为自变量进行赋值(具体见表3)，并分别进行单变量Logistic回归分析，结果见表4。由表4可知，在单因素分析中，两组差别有统计学意义的影响因素包括：女方年龄、精子DNA碎片率、SCH、受精方式。

四、多因素Logistic回归分析

将女方年龄、SCH、男方精子DNA碎片率、受精方式作为多因素Logistic回归分析的候选变量，采用后退法对变量进行筛选，最后进入模型的变量和参数见表5。由表5可知，除男方DNA碎片率外，女方年龄、SCH、受精方式均P<0.05，因此女方年龄、SCH、受精方式与生化妊娠有关，结合回归分析前对各变量的赋值及系数均为负值，分析得出年龄偏大、合并SCH未治疗或治疗后仍不正常、ICSI受精患者更易发生生化妊娠。

表1 两组患者一般情况比较 [(-±s)，n (%)]

表2 两组患者助孕治疗相关指标比较 [(-±s)，n (%)]

表3 研究变量的定义及赋值

表4 生化妊娠相关因素的单因素Logistic分析结果

注：*P<0.05

表5 与生化妊娠相关因素的多因素Logistic回归分析

讨 论

生化妊娠是早期妊娠丢失(FTPL)的一种特殊类型，在自然受孕的妇女中发生率约为30%，在IVF/ICSI中发生率约为12%～30%[3]，本研究中生化妊娠在IVF/ICSI中的发生率为15.85%，与文献[3]报道相符。生化妊娠发生机制尚不完全明确，可能与胚胎染色体异常(主要为非整倍体)、母体内分泌、免疫等异常，精子质量异常，环境中有毒、有害物质等有关[3]。对这些因素进行相关分析的报道不多，尤其对胚胎染色体、环境因素的检测相对困难，因此我们分析了临床常见的一些指标：患者一般情况、病史、IVF/ICSI过程中的相关数据，发现女方年龄、SCH、ICSI受精是生化妊娠的危险因素。

一、重视女性高龄患者

女性年龄越大，卵母细胞线粒体、纺锤体老化和同源染色体不分离、姐妹染色单体过早分离越容易发生，卵母细胞非整倍体发生率增加、胚胎质量下降，进而导致妊娠率下降、生化妊娠率增加[7]。本研究结果显示高龄是导致生化妊娠的因素之一，因此重视高龄患者，促排卵前尽量改善卵母细胞质量有望降低生化妊娠率。女性年龄增加，卵母细胞质量下降、形态学可能发生异常，出现胞浆颗粒化、极体碎裂、卵周隙增大等，研究显示生化妊娠比正常妊娠卵母细胞形态异常所占的比例增加[5]。因本研究样本量较小，生化妊娠组卵母细胞异常周期仅1个，正常宫内孕组仅2个，没有进行统计学分析，有待今后扩大样本量后再进行研究。

二、IVF前重视甲状腺功能检查并纠正SCH可减少生化妊娠

本研究结果显示SCH是生化妊娠的危险因素。不育妇女中SCH的发生率约4.0%～15.4%[8]。甲状腺素在维持人类正常生殖功能中发挥重要作用：TSH及其受体和甲状腺激素受体在人卵巢颗粒细胞和卵母细胞均有表达，协同调节颗粒细胞增殖与凋亡、P分泌、滋养层细胞侵入等[8-9]。SCH患者体内性激素结合球蛋白(SHBG)减少，游离睾酮与雌二醇(E2)增加，抑制FSH分泌，直接降低颗粒细胞对FSH的反应性，影响卵母细胞的发育；升高的TSH通过对垂体-甲状腺轴的负反馈，使促甲状腺素释放激素(TRH)升高，多巴胺分泌减少，引起高泌乳素血症，导致排卵障碍、黄体功能不足[10]；甲状腺素协同EGF的作用下降，影响胚胎着床及正常妊娠的维持[11]；降钙素水平降低，调节子宫内膜细胞分化和胚泡发育的作用下降，影响胚胎着床，导致生化妊娠。

IVF过程中患者体内E2、SHBG、P水平升高，对于TSH及甲状腺激素水平的要求可能与自然妊娠不完全一致。研究发现IVF/ICSI周期中TSH>2.5 mU/L时，患者的流产率升高，活产率、种植率降低，TSH>4.2 mU/L时流产率高达24.24%，生化妊娠率高达11.80%[1]。因此，2012年美国内分泌协会临床实践指南建议，有SCH或不孕症病史、年龄超过30岁、甲状腺抗体阳性等情况的妇女，孕前最好控制TSH水平在2.5 mU/L以内[6]。我们参照该指南给予SCH患者左甲状腺素片治疗，结果正常宫内妊娠组比生化妊娠组TSH<2.5 mU/L的周期所占比例更高，统计分析也显示SCH未治疗或治疗后未正常是生化妊娠的危险因素，与文献[12]报道一致。目前国内尚没有指南规定IVF患者孕前SCH的诊断标准、治疗目标等，有必要就此深入研究。

三、严格掌握ICSI指针有望减少生化妊娠

目前，ICSI对胚胎着床率、生化妊娠率是否有影响还存在争议[13-14]。本研究数据分析显示ICSI是生化妊娠的危险因素。ICSI导致生化妊娠的可能原因为：ICSI适应证包括严重少、弱、畸形精子症，附睾、睾丸取精，前次IVF受精失败者，这部分患者本身可能存在严重的精子或卵母细胞缺陷，导致胚胎质量差、发育停滞；ICSI过程避开了正常受精时精卵融合后触发的卵母细胞皮质反应，但可能损伤卵母细胞的微管微丝系统，影响受精卵及胚胎发育[14]。男性年龄较大时精子DNA碎片率升高，精子染色质结构稳定性降低，导致胚胎质量下降甚至发育停滞，DNA碎片率≥30%时流产率增加[15]。我们的数据显示两组患者不孕因素构成比接近，且与生化妊娠没有相关性；男性年龄、DNA碎片率亦与生化妊娠没有相关性。因此，生化妊娠可能与ICSI适应症无关，而与ICSI操作本身对卵母细胞、胚胎质量的影响有关，因此严格掌握ICSI指征可能会减少生化妊娠。但因本研究样本量较小、生化妊娠的影响因素又众多，后续还需全面深入地研究加以验证。

成功妊娠需要优质的胚胎和容受性正常的子宫内膜。生化妊娠与优胚率、是否移植优质胚胎的相关性尚没有定论[4]。本研究中优胚率、是否移植优质胚胎与生化妊娠没有明显相关性。可能与以下因素有关：采用形态学标准评分胚胎，不能完全反映胚胎染色体是否正常及预测胚胎发育潜能，形态学表现为优质胚胎的染色体异常发生率仍高达32.8%[16]；即使对胚胎进行植入前非整倍体筛查(PGS)，选择染色体正常的胚胎移植，也不能降低生化妊娠率[17]，提示胚胎染色体异常不是生化妊娠的主要原因。目前我中心尚未进行单胚胎移植，故将移植胚胎中至少有1个优质胚胎的周期作为参数之一，开展单胚胎移植后可以直接比较“优质胚胎”周期和“非优质胚胎”周期。有研究还发现HCG日内膜厚度<9 mm、P≥9.51 nmol/L者生化妊娠发生率升高[18]，但也有研究否定这种相关性[5]。本研究显示两者均与生化妊娠无关，可能因为按照我中心取消移植的标准，这些患者大部分全胚冷冻，因此减少了可能发生的生化妊娠。有研究报道既往合并自然流产史的患者发生生化妊娠的概率更高[4]，本研究结果未显示两者的相关性，这可能与排除合并子宫畸形的周期，IVF前进行充分检查和治疗，根除了既往导致自然流产的部分因素有关。另外，IVF中首选优质胚胎移植，充分的黄体支持和密切随访也大大削减了可能导致自然流产的因素。

综上所述，IVF治疗前重视甲状腺功能检查及治疗，严格掌握ICSI指征，尤其注意高龄患者，尽量改善其卵母细胞质量有助于减少生化妊娠。导致IVF中生化妊娠的原因十分复杂，每个生殖中心患者的特点、预处理措施及促排卵方案、实验室培养条件均不同，需要结合自己的实际情况寻找最可能的原因并给予针对性干预。

[1] 庄广伦.胚胎植入的临床疑惑[J].生殖医学杂志，2013，22：215-218.

[2] 任秀莲，刘平.着床失败、生化妊娠和流产是一码事吗？[J].生殖医学杂志，2014，23：191-193.

[3] Weselak M，Arbuckle TE，Walker MC，et al.The influence of the environment and other exogenous agents on spontaneous abortion risk[J].J Toxicol Environ Health B Crit Rev，2008，11：221-241.

[4] 龙文，尹太郎，赵庆红，等.冻融胚胎移植中周期生化妊娠发生率及影响因素分析[J].中华临床医师杂志(电子版)，2011，5：5154-5157.

[5] 林蕾，全松圆，陈雷宁，等.体外受精-胚胎移植中卵子及胚胎质量对生化妊娠的影响[J].广东医学，2010，31：2496-2498.

[6] Stagnaro-Green A，Abalovich M，Alexander E，et al.Guidelines of the American Thyroid Association for the diagnosis and management of thyroid disease during pregnancy and postpartum[J].Thyroid，2011，21：1081-1125.

[7] Chapuis A，Gala A，Ferrières-Hoa A，et al.Sperm quality and paternal age：effect on blastocyst formation and pregnancy rates[J].Basic Clin Androl，2017，27：2.

[8] Reh A，Grifo J，Danoff A.What is a normal thyroid stimulating hormone (TSH) level? Effects of stricter TSH thresholds on pregnancy outcomes after in vitro fertilization[J].Fertil Steril，2010，94：2090-2092.

[9] Dittrich R，Beckmann MW，Oppelt PG，et al.Thyroid hormone receptors and reproduction[J].J Reprod Immunol，201l，90：58-66.

[10] Hekimsoy Z，Kafesçiler S，Güçlü F，et al.The prevalence of hyperprolactinaemia in overt and subclinical hypothyroidism[J].Endoer J，2010，57：1011-1015.

[11] 吴洁.再论甲状腺功能与女性生殖[J].生殖医学杂志，2014，23：345-350.

[12] 贾博钦，宋学茹，赵晓徽，等.预防性控制血清促甲状腺素水平对IVF/ICSI-ET妊娠早期的影响[J].中国计划生育学杂志，2014，22：830-833.

[13] Charehjooy N，Najafi MH，Tavalaee M，et al.Selection of sperm based on hypo-osmotic swelling may improve ICSI outcome：A preliminary prospective clinical trial[J].Int J Fertil Steril，2014，8：21-28.

[14] 李春燕，明蕾，张露，等.激素替代治疗冻融胚胎移植妊娠结局的相关因素分析[J].生殖医学杂志，2014，23：271-275.

[15] Björndahl L，Kvist U.Human sperm chromatin stabilization：a proposed model including zinc bridges[J].Mol Hum Reprod，2010，16：23-29.

[16] Minasi MG，Colasante A，Riccio T，et al.Correlation between aneuploidy，standard morphology evaluation and morphokinetic development in 1730 biopsied blastocysts：a consecutive case series study[J].Hum Reprod，2016，31：2245-2254.

[17] Musters AM，Repping S，Korevaar JC，et al.Pregnancy outcome after preimplantation genetic screening or natural conception in couples with unexplained recurrent miscarriage：a systematic review of the best available evidence[J].Fertil Steril，2011，95：2153-2157.

[18] 奚秋萍，冒韵东，高彦，等.体外受精-胚胎移植周期中注射人绒毛膜促性腺激素日患者血清孕酮水平与妊娠结局的相关性[J].中华妇产科杂志，2010，45：118-124.

[编辑：肖晓辉]

AnalysisofinfluencingfactorsofbiochemicalpregnancyafterIVF/ICSI

GONG Yan*，ZHAO Zi-lin，LIU Wei-xin，ZENG Jiu-zhi，YE Fei，LAI Wei

CenterofReproductiveMedicine，SichuanMaternalandChildren'sHospital，Chengdu610045

Objective： To analyze the influencing factors of the biochemical pregnancy after IVF/ICSI-ET.

Methods： The data of 68 biochemical pregnancies and 307 intrauterine pregnancies in IVF/ICSI-ET cycles from January 2014 to December 2016 were retrospectively analyzed.The general conditions and the assisted pregnancy related indexes of the two groups were compared.The influencing factors of biochemical pregnancy were screened by univariate regression logistic analysis.

Results： There was no significant difference in general conditions and the assisted pregnancy related indexes between the two groups (P>0.05).Multivariate logistic regression analysis showed that female age，subclinical hypothyroidism (SCH) and fertilization method were the influencing factors of biochemical pregnancy (P<0.05).The elder women with SCH who did not be treated or were still abnormal after treatment were more prone to biochemical pregnancy after ICSI treatment.

Conclusions： The thyroid function tests should be paid attention to，SCI should be timely corrected before IVF/ICSI-ET，and ICSI indications should be strictly controlled.The elder patients need more attention to improve the quality of oocytes.All the measures will help reduce the incidence of biochemical pregnancy.

IVF-ET； Biochemical pregnancy； Age； Subclinical hypothyroidism； ICSI

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.09.009

2017-02-14；

2017-04-07

四川省卫计委课题(16PJ386)

龚衍，女，汉族，四川人，硕士，副主任医师，生殖医学专业.(*

)