酵母菌高温发酵用种子培养基对比与筛选试验

王方方，杜风光，刘 钺，徐灵鹤，姜 超，马焕新，郑 彬，张彩莹

(1.河南天冠企业集团有限公司，河南南阳473000； 2.南阳师范学院生命科学与技术学院，河南南阳473000)

酵母菌高温发酵用种子培养基对比与筛选试验

王方方1，杜风光1，刘 钺1，徐灵鹤1，姜 超1，马焕新1，郑 彬1，张彩莹2

(1.河南天冠企业集团有限公司，河南南阳473000； 2.南阳师范学院生命科学与技术学院，河南南阳473000)

主要研究了酵母菌种子培养基的替代问题。通过将玉米醪液、玉米滤液与传统麦芽汁培养基培养的酵母菌种进行38℃发酵对比试验，发酵不同浓度梯度木薯、玉米发酵醪，发酵液酒度差异显著，如在玉米∶水=1∶2时，玉米原料种子培养基培养的酵母菌进行高温发酵的发酵液酒精度较麦芽汁高1%vol左右；更换酵母菌菌种进行发酵对比试验，发酵液酒精度相当或者玉米种子培养基略占优势；从原料价格成本进行比较，玉米培养基的价格显著低于麦芽汁培养基。

酵母菌； 麦芽汁； 玉米醪液； 玉米滤液； 高温发酵

在当前石油问题日益严峻及大气污染日趋严重的形势下，乙醇作为可持续的清洁燃料倍受青睐。发酵法生产乙醇技术逐渐成熟，生产工艺更是向着无污染、零排放的环保目标不断改进[1]。酒精属于绿色产品，酒精的生产工艺也正在向着绿色、环保、节能的方向迈进。酵母菌的高温发酵不仅能够解决夏季部分地区因为温度太高导致酵母菌无法正常发酵的问题，还可以节约大量冷却水的使用[2-4]。目前，人们正采用不同的手段，从不同的角度来改进酒精酵母的生产性能，并取得了一定的进展[5-6]。

菌种种子培养基的选用是菌种能够正常生长和良好发酵的前提。培养基的选用原则是在满足菌体的生长和发酵需求的基础上，力求经济节约，也是微生物发酵进行工业化生产时需要进行考量的很重要的一个方面。在本研究中将选用替代培养基与传统培养基进行发酵对比，在发酵结果和经济性方面进行评估，择优选择。

1 材料与方法

1.1 材料

木薯粉：取天冠乙醇公司生产车间木薯块，加工粉碎；玉米粉：取自天冠乙醇公司粉碎车间。

菌种：所用菌种为酵母菌1308经自然选育所得，编号为Tg1308，保存于车用生物燃料技术国家重点实验室菌种选育与保藏中心。

1.2 实验方法

1.2.1 种子培养基制备方法

14°Bx麦芽汁培养基：将大米和大麦芽按1∶3质量比混匀，大米首先蒸熟，然后在60～65℃条件下糖化4～6 h，过滤，稀释至所需浓度；自然pH值。

玉米醪液培养基：将玉米和水按1∶2的比例混合后，加入液化酶，升温至90℃，保温2 h，分装。

玉米滤液培养基：将玉米醪液进行过滤，所得滤液进行分装，灭菌。

1.2.2 发酵培养基制备方法

玉米或木薯与自来水按照一定的比例进行混合，调节其pH5.50左右，按照20 U/g干料量加入液化酶（酶活为30000 U/mL），将料液以86℃液化1 h，液化完毕立即进行冷却并补足液化期间挥发水分。

1.2.3 种子转接及扩培方法

液体试管接种：从Tg斜面上挑取1环接入不同的培养基中，以30℃培养16 h。

小三角瓶接种及培养：将液体试管摇匀后接入小三角瓶中，以30℃、160 r/min培养。

发酵培养基接种：发酵培养基按照干料量的2.8‰、1.3‰添加尿素、磷酸氢二钾和硫酸镁，120 U/g干料糖化酶（酶活为100000 U/mL），按照30%接种量进行接种，摇匀后置于38℃下发酵，定时称重，以失重小于0.2 g/h作为判断发酵结束的标准。

1.2.4 测定方法

1.2.4.1 细胞数测定[7]

发酵液稀释至合适梯度，摇匀后通过细胞计数板16×25进行计数。计数时统计计数板四角和中央的中格（共5个中方格）内酵母细胞的总细胞数，求和后通过公式（1）计算1 mL发酵液中的总细胞数：

注：5个中方格的总细胞数为A，稀释倍数为B。

1.2.4.2 种子液糖含量的测定

培养基中可供异养小球藻利用的糖主要为麦芽糖和葡萄糖，糖的测定通过高效液相色谱法进行。取适量种子液，3000 r/min离心，取上清液进行测定。分离柱为AminexHPX-87H，L×HD为300× 7.8，流动相为0.003 mol/L稀H2SO4溶液，流速为0.5 mL/min，葡萄糖保留时间为10.34 min。进样量为5µL，柱温65℃。

1.2.4.3 发酵液酒精度测定方法[8]

准确量取发酵醪100 mL，注入1000 mL平底烧瓶内，加水120 mL，将平底烧瓶和冷凝器连接好，注意勿漏气。置电炉上加热蒸馏，馏出液收集于100 mL量筒内，当馏出液达到100 mL刻度时，取下摇匀，以酒度计与温度计同时测其酒精度和温度，根据酒精度和温度换算表，换算成20℃时的酒精度。

2 结果与讨论

2.1 传统培养基与新培养基种子培养对比试验

为了考察传统麦芽汁培养基与玉米醪液培养基在培养酵母菌后种子液中糖分的消耗情况及酵母菌细胞数，进行了对比试验。从酵母斜面上各挑1环接入不同的10 mL液体试管种子培养基中，以30℃培养16 h，转接入100 mL/250 mL小三角瓶培养基中，试管和小三角瓶种子液均进行细胞计数，结果见表1；试管种子液离心后上清液进行液相色谱分析，结果见表2。

表1 液体试管与小三角瓶细胞数计数情况(108cfu/mL)

从不同种子培养基种子液中细胞数可以看出，经过液体试管培养后细胞数差别不大，而经小三角瓶转接培养后传统麦芽汁培养基中细胞数明显高于玉米粉醪液和滤液中酵母细胞数。对于发酵而言，接入发酵培养基中细胞数并非越多越好，因为发酵培养基的作用是为菌体的生长和目标产物的合成提供营养，若接种量过多，造成过多的营养用于菌体的生长而用于代谢产物合成的营养较少；若接种量偏少，造成培养基中营养成分利用不彻底，故接入的菌体数量不宜太少或过多。

表2 试管接种前后培养基中各成分含量变化 (g/100 mL)

由表2可以看出，种子培养基中营养成分的含量变化主要体现在葡萄糖的消耗上，由于培养基中葡萄糖含量充足，因而酵母菌没有消耗麦芽糖，从糖的消耗情况和种子液中酵母细胞数进行比较，耗糖多者生成的酵母细胞数亦多。

2.2 不同种子培养基发酵对比试验

仅通过比较种子液中酵母菌细胞数和糖耗情况无法确定培养基的优劣，还需从不同种子培养基培养的酵母菌在产物合成方面的差异进行对比，即发酵结果的对比。按照木薯与水质量比1∶2进行配料、液化，接种后以38℃发酵，发酵结束后对发酵液进行理化指标分析，结果见表3。

表3 不同种子培养基发酵结果对比

从表3可以看出，在接种量、发酵培养基、发酵条件完全相同的条件下，不同种子培养基接种发酵后结果差别很大，在料水比1∶2的配料浓度下，发酵液酒精度可相差0.8%vol左右，说明玉米培养基中存在提高酵母菌酒精转化率的物质。

2.3 不同配料浓度下种子培养基发酵对比

由于2.2所述试验为初步尝试，在初步发现不同种子培养基培养酵母菌进行高温发酵效果有了显著差异后，为了获得更为精准的试验数据，选用粒度更细、质量更好的木薯粉进行发酵试验，希望在更大程度上避免因为原料的不均匀性导致的数据误差。为了考察种子培养基对不同发酵醪浓度的发酵效果，分别配制了料水比为1∶1.8、1∶1.9和1∶2.0的木薯液化醪，按干料比例加入相应量的无机盐后，置于38℃下静置发酵64 h，发酵结果见表4。

表4 种子培养基对不同浓度发酵醪的发酵效果

从表4可看出，更换新的木薯原料后，菌种对于料水比1∶2.0的发酵培养基与之前所用原料的发酵效果（表3）进行对比发现，酒精度均提升了1%vol；另从对较高浓度液化醪的发酵效果看，菌种在38℃条件下的发酵还有提升的空间，从残总糖数据看，菌种对料水比1∶1.9的配料浓度可以在38℃的温度条件下发酵彻底，考虑到通过料水比表达发酵能力的不准确性，折算成更为精确的淀粉含量，通过测定得出，木薯粉中淀粉含量为72.40%，则液化醪中的淀粉含量为24.13%，即在38℃条件下酵母菌可以彻底发酵淀粉含量为24.13%的液化醪，得出此结论的前提是所用种子培养基为玉米培养基。

2.4 不同种子培养基对玉米液化醪的发酵效果

考虑所用原料的差异是否会对发酵产生一定的影响，使用玉米液化醪进行试验，以检验在不同的液化培养基中酵母的发酵效果。试验仍采用不同的浓度梯度，按照料水比1∶1.8、1∶1.9和1∶2.0的配比进行液化、接种，置于摇床中以38℃静置发酵48 h，发酵结果见表5。

表5 种子培养基在不同浓度玉米醪中发酵结果

由表5可以看出，玉米种子培养基在玉米液化醪中的发酵结果优于麦芽汁种子培养基，在料水比1∶2.0的液化醪中发酵，发酵液酒精度可提高1%vol，料水比浓度升高至1∶1.8，发酵液酒精度也可提高0.6%vol，而且是在糖耗相当的前提下。这说明玉米培养基是提高发酵液酒精度的关键因素。

2.5 更换酵母菌种进行发酵对比试验

为了考察种子培养基对酵母菌种的适用性，选择生产常用的MZ和1308菌株进行发酵试验，按照料水比1∶2配制木薯料液进行液化、接种后以38℃发酵，发酵结果见表6。

表6 MZ和1308对种子培养基的适用性试验

通过MZ和1308菌种的发酵结果可以看出，1308在麦芽汁培养基培养后，接种到发酵醪后可将其中淀粉糖彻底发酵，而接种玉米培养基后发酵液中残还原糖和残总糖稍高，但是所得发酵液酒精度略高于麦芽汁培养基；MZ的发酵结果与1308相似，只是玉米培养基接种发酵醪后所得发酵液酒精度显著高于麦芽汁培养基的发酵结果，推测其原因可能是MZ较1308菌株具有更强的浓醪发酵能力。由上可以说明，玉米培养基对酵母菌株具有较好的适用性。

2.6 酒精度提升原因探究试验

为了查找玉米种子培养基和麦芽汁种子培养基对相同液化醪发酵结果存在的差异及原因，需从接入菌种的两个方面着手：一是比较种子液中各种成分的含量，确定是否是因为营养成分的增加导致的发酵差距；二是比较接入的酵母菌细胞的差异，查找是否因为种子培养基的不同导致培养出的酵母细胞的发酵性能存在差别。

按照料水比1∶2.0的配比将木薯和玉米分别进行液化，以270 g/500 mL三角瓶进行分装，依据比例加入尿素和无机盐、糖化酶等。接种时先称取30 g菌液，离心后上清液进行液相色谱分析，菌泥加无菌水洗涤后再次离心，弃上清液，菌泥用无菌水转移至发酵瓶中，转移量为30.0 g。随后以38℃静置发酵，为了保证试验数据的准确性，每组接种6瓶进行平行性发酵，结果见表7和表8。

表7 使用木薯培养基进行发酵的结果

从表7可以看出，将种子液上清液离心并将菌泥进行洗涤后接种，进行高温发酵。麦芽汁培养基与玉米滤液的发酵结果一致，而玉米醪液的酒精度和淀粉利用率仍较高，推测其原因应该是玉米醪液中含有大量颗粒状的物质，经离心后和菌泥共同沉淀，被接入至发酵培养基中，在接种的同时等同于向培养基中接入了一定量的培养基，或者说是增加了发酵醪的浓度。该浓度处于菌种发酵能力范围内，因而发酵液可以获得较高的酒度。

为了了解接种方式对玉米醪培养基发酵的影响，按照相同的操作方法对玉米发酵醪进行试验，试验结果见表8。

表8 使用玉米培养基进行发酵的结果

从表8可以看出，使用玉米发酵醪进行发酵的结果与木薯的发酵结果比较相似，推测是由于其中营养成分含量的差异导致发酵结果的差异，为了更进一步分析其中的原因，对离心后种子液的上清液进行体积统计（以30 g种子液为准）和液相色谱分析，其中麦芽汁和滤液的体积为29 mL，而醪液的体积只有12 mL，液相分析结果见表9。

表9 三角瓶种子上清液液相分析结果 (g/100 mL)

比较上清液中的营养成分，主要比较其中麦芽糖和葡萄糖含量。可以看出，醪液和滤液中葡萄糖的含量较高，而麦芽汁中葡萄糖含量很低，麦芽糖含量很高，从一个麦芽糖分子可转化为两个葡萄糖分子的角度考虑，麦芽汁中糖含量并不低，为什么酵母菌接种发酵后发酵液酒精度偏低呢？是否是因为其中的麦芽糖不能较快地为酵母菌所利用？为此，在试管培养成熟向小三角瓶转接时，对小三角瓶培养基进行滴加2滴糖化酶的处理，以提高小三角瓶种子液中葡萄糖含量，加入糖化酶后的小三角瓶酵母种子上清液中麦芽糖含量为3.206 g/100 mL，葡萄糖含量为9.286 g/100 mL，其糖含量与玉米滤液中糖含量比较接近。接种木薯发酵醪（料水比1∶ 2），38℃摇床培养后发酵结果见表10。

表10 麦芽汁种子培养基加入糖化酶后发酵对比结果

由表10可以看出，麦芽汁摇瓶种子培养基加入2滴糖化酶后进行种子培养和发酵，其发酵结果和没有进行糖化酶添加的发酵结果较接近，说明发酵液酒精度的提高原因并非是由于种子液中的营养物质影响的，或者说是并非是由液相检测到的几种营养物质所影响的。具体的原因还需进一步研究确定。

2.7 种子培养基原料成本核算

玉米醪液培养基与麦芽汁培养基的制备成本进行比较，依据标准是产生一定体积的14°Bx麦芽汁需要的大麦芽和大米的重量以及产生干物质含量为30%的玉米醪所需的玉米的重量，具体结果见表11。

表11 产生相同体积培养基所需原料质量对比

由表11可以看出，制备相同量的麦芽汁培养基和玉米醪培养基，所需原料的质量差别较大，制备麦芽汁所需的大麦芽和大米的质量明显多于制备玉米醪的玉米的质量。而从市场价格来说，大麦芽和大米的市场价格应为玉米市场价格的2倍以上。因此，从原料成本的角度考虑，玉米培养基优于麦芽汁培养基。

3 结论

通过以上试验结果，可以看出，玉米培养基作为酵母菌传统种子培养基的替代培养基，在利用其培养的菌种以38℃发酵时显示出明显的优势，具体如下：

（1）用不同种子培养基培养的酵母菌种接种木薯发酵培养基，所接木薯培养基配制成不同浓度梯度，发酵结束时所得发酵醪酒精度指标进行比较发现，对于相同浓度的木薯发酵醪而言，用玉米培养基培养的菌种接种后的发酵醪酒精度显著高于麦芽汁培养基菌种的发酵结果，不同浓度梯度的发酵培养基均显示出相同的酒精度差异；为了验证培养基对原料的适用性，进行玉米发酵培养基发酵对比试验，由于玉米原料淀粉含量显著低于木薯的淀粉含量，导致相同配料浓度下发酵醪酒精度较低，但是比较不同种子培养基接种相同浓度发酵醪的发酵结果，可以看出玉米培养基的发酵醪酒精度仍具有显著优势。

（2）通过更换酵母菌种接种麦芽汁培养基和玉米培养基进行高温发酵对比试验，可以看出玉米培养基所得发酵液酒精度稍高于或显著高于麦芽汁培养基，这取决于所用酵母菌种的浓醪发酵能力。

（3）为了探究玉米种子培养基具有显著的发酵优势的原因，进行了接种方式对比试验、种子上清液液相成分检测以及更换酵母菌种进行发酵对比试验，推测酒精度提高的原因是玉米培养基中具有比麦芽汁培养基更为丰富的营养成分，且这些营养成分可为Tg菌种利用，或者说是可为具有浓醪发酵能力的酵母菌种利用。

（4）种子培养基成本对比：通过对比制备相同量的种子培养基所需的原料质量，发现制备麦芽汁培养基所需原料量多于玉米培养基所需量，加之麦芽汁原料大麦芽和大米的市场价格显著高于玉米的市场价格，说明麦芽汁的成本高于玉米。综上所述，本文所选的麦芽汁替代培养基——玉米培养基适用于Tg酵母的高温发酵，更确切的说是适合具有浓醪发酵能力的酵母的发酵，对于普通酵母的发酵而言，玉米培养基具有和麦芽汁培养基相同的发酵效果，因此可以作为酵母菌的一种替代种子培养基进行使用。

[1]张锋,杜风光,孙沛勇,等.一种酒精糟液与中温厌氧水共回用发酵酒精的方法：ZL201310343400.8[P]. 2013-11-06.

[2]刘海臣,冉淦侨,张兴,等.酒糟中超高温耐高酒精度酵母菌株的选育[J].酿酒科技,2007(5)：28-31.

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“大酱仁”第二届国家品酒师资格培训班在仁怀举办

本刊讯：由中国酒业协会和贵州省质检院仁怀分院共同主办的“大酱仁”第二届国家品酒师资格考核培训班于2017年8月1日至8日在贵州省质检院仁怀分院举办。来自仁怀市酒类企业及河南、陕西、浙江、深圳等地的学员共153名参加了培训考核。中国酒业协会刘秀华副理事长出席了开班典礼，中国酒业协会培训部毛雪主任到场监考并参加了结业典礼。本次培训考核由贵州省著名白酒专家及取得品酒师教师资格证书的教师组成的专家组组织实施。培训考核内容包括理论和实操，理论培训内容以中国酒业协会编写修订的《品酒师培训教材》为主，包括各种香型白酒工艺特点、酒体风格特征、风味成分分析等知识讲座，结合贵州白酒行业的实际情况，增加了酱香轮次酒的认识和勾调实操内容。实操培训包括香型鉴别、各香型质量差、酒度差、单体化合物鉴别等内容。学员纷纷表示此次培训班内容丰富，专家授课内容贴近生产实际，课程安排充实紧凑，学员受益匪浅。（骆佳龙、小雨、萤子、晓文）

Comparison and Screening of Culture Mediums of Yeast Strains for High-Temperature Fermentation

WANG Fangfang1,DU Fengguang1,LIU Yue1,XU Linghe1，JIANG Chao1，MA Huanxin1，ZHENG Bin1and ZHANG Caiying2
(1.Tianguan Group Co.Ltd.,Nanyang,Henan 473000;2.School of Life Science and Technology, Nanyang Normal University,Nanyang,Henan 473000,China)

In this study,the substitute of culture mediums of yeast strains was explored.The fermentation contrast experiment was performed at 38℃of yeast strains cultured by corn mash,corn filtrate,and traditional wort respectively.The results suggested that there was significant difference in alcohol content fermented by yeast strains cultured by mediums of different concentration.For example, while the ratio of corn and water was 1∶2,alcohol content of fermenting broth by yeast strains cultured by corn mash was 1%vol higher than that cultured by wort.Meanwhile,contrast experiment of different yeast strains cultured by the same culture mediums was performed.The results suggested that corn mash was a better choice.Compared with wort culture mediums,the price of corn culture mediums was evidently lower.

yeast;wort;corn mash;corn filtrate;high temperature fermentation

TS262.3；TS261.1；TS261.4

A

1001-9286（2017）09-0078-06

10.13746/j.njkj.2017123

2017-05-09

王方方（1983-），女，硕士研究生，主要从事菌种的保藏与筛选工作。

优先数字出版时间：2017-07-14；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170714.1000.004.html。