脂肪乳灌胃诱导非酒精性脂肪肝大鼠肝纤维化及β-catenin mRNA表达的影响*

杨文强钟新生黄炎马威杨家耀

1.武汉市第一医院中心实验室（湖北 武汉，430030） 2.武汉市第一医院检验科 3.武汉市第一医院消化内科

脂肪乳灌胃诱导非酒精性脂肪肝大鼠肝纤维化及β-catenin mRNA表达的影响*

杨文强1钟新生2黄炎2马威1杨家耀3△

1.武汉市第一医院中心实验室（湖北 武汉，430030） 2.武汉市第一医院检验科 3.武汉市第一医院消化内科

目的：用脂肪乳灌胃方法建立非酒精性脂肪肝大鼠模型，观察不同时间点非酒精性脂肪肝大鼠肝组织病理改变与Wnt信号通路中关键基因表达的联系。方法：20只wistar大鼠随机分为两组，造模组16只，按10ml/kg剂量灌胃脂肪乳（25%猪油，10%胆固醇，1%丙塞优，2%脱氧胆酸钠）；空白组4只，按相同剂量灌胃生理盐水。分别于第4、6、8、10周时随机从造模组选4只大鼠，称重麻醉后采血，检测生化指标；取肝组织冰冻切片进行油红O染色；肝组织石蜡切片HE染色后，镜下观察并进行NAS（非酒精性脂肪性肝病活动度评分）评分；分别检测不同时间点大鼠肝组织Wnt3αmRNA、β-cateninmRNA、Col1a1mRNA（胶原蛋白I）表达。结果：与空白组比较，模型组大鼠4周时TC（总胆固醇）开始显著增高（P＜0.01），8周时TG、LDL-C（低密度脂蛋白胆固醇）开始显著增高（P＜0.05）。模型组大鼠4周时，肝细胞肿胀，轻度脂肪肝变。6周时，肝脏指数开始显著增高（P＜0.05），炎性细胞浸润明显，中度脂肪肝变。8周时肝细胞内出现大量脂滴（大泡性为主），重度脂肪肝变，见纤维增生。10周时，肝细胞气球样变，伴点状坏死，见明显的纤维增生。模型组大鼠随造模时间延长，Wnt3α、β-catenin、Col1α1 mRNA表达显著增高。结论：Wnt经典信号通路介导了本模型脂肪乳灌胃诱导的肝纤维化进程，10周时出现肝纤维化。

非酒精性脂肪性肝病；脂肪乳；大鼠模型；β-catenin

Fund sourcesDu JianMin studioThe construction project of inheriting the studio of national famous traditional Chinesemedicine experts in 201

图1 各组大鼠肝组织病理图(HE,×200)

图2 各组大鼠肝组织病理图(油红O染色×200)

近年来，随着我国生活水平的提高和饮食结构的改变，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发病率逐渐增高，并有年轻化趋势［1］，严重威胁人类健康。研究表明，大量高脂、高糖的摄入是导致脂肪肝发生的重要因素［2］。我们采用脂肪乳灌胃方法制备NAFLD大鼠模型，观察不同时间点大鼠肝组织病理改变与Wnt经典信号通路中关键基因表达的联系，以期为今后研究提供良好的基础。

1.材料与方法

1.1 实验动物 Wistar大鼠20只，雄性，SPF级，购于湖北省动物中心（动物合格证编号No.42000600013948），动物实验完成于武汉市第一医院SPF动物室（湖北省实验动物设施使用证号No.00138894）。动物室内环境温度21±1℃，湿度50± 15%，12h明暗交替。动物自由饮去离子水，饲喂经辐照消毒的维持饲料（北京华阜康公司提供）。

1.2 实验试剂及药物 胆固醇、吐温80、1，2-丙二醇、甲醇均购于国药集团化学试剂有限公司，批号分别为20120409、20151105、20160114、20130608；丙硫氧嘧啶（德国Lonapham Rudolf Lohmann GmbH KG生产，进口药品注册证号：H20130868，批号1413890）；脱氧胆酸钠（索莱宝公司批号No.1226A0210）；油红O染液（武汉赛维尔，批号：160839）；猪油（市售）；肌酐（Cr）检测试剂盒（酶法）（积水医疗株式会社，批号：824RBN）；以下试剂均购于贝克曼库尔特实验系统（苏州）有限公司：总胆固醇（TC）检测试剂盒（酶法）批号AUZ3913、甘油三酯（TG）检测试剂盒（GPO-POD法）批号AUZ3765、丙氨酸氨基转移酶（ALT）检测试剂盒（乳酸脱氢酶法）批号AUZ3907、（HDL-C）高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒（直接法）批号AUZ3572、低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒（直接法）批号AUZ3564、总蛋白（TP）测定试剂盒（双缩脲法）批号AUZ3710、白蛋白测定试剂盒（溴甲酚绿法）批号AUZ3752、尿酸测定试剂盒（尿酸酶-过氧化物酶法）

批号AUZ3903、尿素（BUN）测定试剂盒（尿素酶-谷氨酸脱氢酶法）批号AUZ3853，引物合成于武汉英骏生物科技有限公司，分子生物学试剂购于上海生工。

1.3 实验设备 全自动生化分析仪、冰冻切片机、CX41型奥林帕斯显微镜、DHG-9023A型恒温烘箱（上海恒一）、RM2235型石蜡切片机（莱卡显微系统有限公司）、TB-718D石蜡包埋机（湖北泰维科技）、DFC295型IMS图像分析系统（武汉华联科）、尼康D5100数码相机、Applied Biosystems Veriti型PCR仪、Bio凝胶成像分析仪。

1.4 脂肪乳灌胃制备大鼠脂肪肝模型［3，4］20只大鼠先随机分为两组：造模组16只，每日上午灌胃脂肪乳；空白组4只，灌胃生理盐水。连续12周。脂肪乳由A液与B液混匀，加水至100ml即得，灌胃剂量为1ml/100g大鼠，每日上午10：00灌胃，每周按体重调整灌胃剂量。A液：25g猪油加热溶解后，加入10g胆固醇，搅拌溶解后加入1g研成粉末的丙赛优，充分混匀后加入25ml吐温80，混匀后备用；B液：向30ml水中加入20ml丙二醇，加热至60℃，再加入2g研成粉末的脱氧胆酸钠，混匀后备用。

1.5 样本采集 在实验过程中，分别于脂肪乳灌胃的第4、6、8、10周分别取4只大鼠，按40mg/kg腹腔注射戊巴比妥麻醉，腹主动脉采血，肝素抗凝，分离血浆，全自动生化分析仪上检测血脂等指标；取部分肝组织，4%多聚甲醛固定备用；部分肝组织冰冻切片并行油红O染色；部分肝组织－80℃冰箱保存备用。

1.6 大鼠肝组织HE染色与油红O染色 组织经4%多聚甲醛固定两天后，常规步骤脱水浸蜡包埋切片；组织切片分别经100%二甲苯、75%二甲苯、100%乙醇、85%乙醇浸泡脱蜡至水；苏木精染液5min染色，流水冲洗1.5min；1%盐水酒精3sec，水洗2sec，促蓝液返蓝6sec，流水冲洗20sec；0.5%伊红染色2min，蒸馏水稍洗2sec；脱水，中性树胶封片。

油红O染色：冰冻切片干燥60min后，用10%甲醛4℃固定10min；倾去固定液，双蒸水洗两次，放置室温干燥45min；用已经预热的油红O染液60～65℃染色15min；80%丙二醇分化2～5min（镜下观察背景接近无色为止）；双蒸水洗3次；苏木素复染40sec，水洗3min；镜下观察，拍照。镜下观察，脂类物质为红色，细胞核为蓝色。

1.7 病理分析与评价 根据《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》（2010年修订版）［5］内容，对肝组织切片在病理学和形态学上进行评价，按NASH临床研究评价体系进行NAS评分并统计分析。NAS评分0～8分：①肝细胞脂肪变：0分（＜5%）、1分（5%～33%）、2分（34%～66%）、3分（＞66%）；②小叶内炎症（20倍镜下计数：0分（无）、1分（＜2个）、2分（2～4个）、3分（＞4个）；③肝细胞气球样变：0分（无）、1分（少见）、2分（多见）。NAS＜3分可排除NASH，NAS＞4分可诊断为NASH，介于两者之间者为NASH可能。

1.8 RT-PCR方法检测Wnt3α、β-catenin、Col1α1 mRNA表达

Trizol提取法提取肝组织总mRNA，经逆转录，PCR扩增，扩增产物琼脂糖凝胶电泳，凝胶自动分析成像系统上进行灰度（IOD）扫描分析，再利用相应的GAPDH灰度值为参照，计算各组各指标mRNA表达的相对强弱。引物序列及扩增条件：Wnt3α引物：上游5'-ATTCCATTCCCAGAGCCTGC-3'，下游5'-CAGGAAGCTCTTGTGGCAGA-3'，产物长度134bp，退火温度58℃，循环次数30；β-catenin引物：上游5'-CTTGGCTATTACGACAGACT-3'，下游5'-CAGCACCTTCAGCACTC-3'，产物长度163bp，退火温度56℃，循环次数30；Col1α1引物：上游5'-TACAGCACGCTTGTGGATG-3'，下游5'-TTGGGATGGAGGGAGTTTA-3'，产物长度190bp，退火温度56℃，循环次数30；GAPDH引物：上游5'-GGTGCTGAGTATGTCGTGGAG-3'，下游5'-CAGTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3'，产物长度292bp，退火温度60℃，循环次数30。

1.9 统计学方法 所有数据经SPSS软件进行正态性检验，所用数据均符合正态分布。再进行方差同质性检验，若方差齐则接受方差结果并用LSD法进行两两比较，若方差不齐，则用Tamhane法进行两两比较。以P＜0.05表示差异有显著性意义。

2.结果

2.1 两组大鼠生化指标比较 经检验，各组数据符合正态分布。Levene检验结果显示，体重、肝指数、BUN、Cr、CD、TG等指标方差齐（P值分别为0.071，0.137，0.130，0.088，0.404）；ALT、TP、TC、HDL-C、LDL-C等指标方差不齐（P值分别为0.005，0.031，0.004，0.039，0.000）。如表1所示，与空白组大鼠比较，4w、6w、8w、10w时间点模型动物体重均显著降低（P值均为0.000），BUN显著增高（P值为0.004，0.000，0.002，0.000）；6w、8w和10w时间点大鼠肝指数显著增高（P值为0.003，0.001，0.000）；8w和10w时间点大鼠TC显著增高（P值为0.008，0.004）；8w和10w时时间点大鼠TG显著增高（P值为0.000，0.000）；10w时间点大鼠TP、HDL-C、LDL-C含量均显著增高（P值分别为0.047，0.001，0.005，0.000）。与4w时间点大鼠比较，8w及10w时间点大鼠肝指数显著增高（P值0.034，0.012），TG显著增高（P值0.000，0.000），TC显著增高（P值0.021，0.010）；10w时间点大鼠体重、Cr、HDL-C、LDL-C均显著增高（P值分别为0.013，0.002，0.002，0.004）。

表1 各组不同时间生化指标比较（±s，n＝4）

表1 各组不同时间生化指标比较（±s，n＝4）

与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与人模型组4W时比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

组别体重（g）肝指数 ALT（u/L） TP（g/L） BUN（mmol/L）空白组 450± 23 0.032± 0.004 60± 6 58.3± 6.7 5.80± 0.61模型组4w 305± 9** 0.039± 0.005 234± 40*72.3± 3.9 7.98± 1.20**模型组6w 305± 41** 0.047± 0.009**268± 78 75.6± 9.9 8.63± 0.95**模型组8w 325± 25** 0.049± 0.007**＃120± 23＃74.0± 4.9 8.20± 1.00**模型组10w 360± 11**＃0.051± 0.005**＃227± 56 77.2± 5.0*8.83± 0.49**F值（P）19.314（0.000）6.859（0.002）7.442（0.002）组KLJ Cr（umol/L）TC（mmol/L）TG（mmol/L）HDL－C（mmol/L）LDL－C（mmol/L）0.31±空白组38.3± 10.3 1.40± 0.18 0.99± 0.17 0.88± 0.140.06模型组4W 38.5± 4.3 4.60± 1.44*0.53± 0.24 0.95± 0.28 3.50± 1.53模型组6W 38.0± 7.2 11.15± 3.88*1.08± 0.39＃1.73± 0.54 8.60± 2.56模型组8W 38.8± 6.0 16.75± 3.26**＃2.33± 0.46**＃＃2.31± 0.43 11.48± 4.21*模型组10W 14.20± 0.43**＃＃F值（P）57.8± 6.5**＃＃24.55± 4.00**＃2.40± 0.39**＃＃2.85± 0.35**＃＃5.590（0.004）23.551（0.000）

2.2 两组大鼠NAS评分比较 经判研，NAS评分结果如下：4W、6W、8W、10W时间点模型大鼠NAS评分依次为（3.25± 0.50）、（4.00±0.817）、（5.00±0.817）、（7.00±0.817），均显著增高，与空白组NAS（0.25±0.50）比较，P值均为0.000。10W时间点模型大鼠NAS评分显著高于4W、6W、8W时间模型大鼠（P值分别为0.000，0.000，0.001）。

2.3 两组大鼠HE染色及油红O染色结果 两组大鼠石蜡切片的HE染色见插页图1，冰冻切片的油红O染色见插页图2。光镜下HE染色可观察到，空白组大鼠肝组织肝小叶结构完整，未见炎性细胞浸润，未见肝细胞坏死，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，肝索、肝血窦清晰，见少量炎性细胞浸润；油红O染色未见脂肪颗粒。模型组大鼠造模4周时，肝小叶结构稍见紊乱，肝细胞稍肿胀；油红O染色见肝细胞胞浆内呈现小泡性脂肪病变。造模6周时，肝细胞脂肪病变加重，肝细胞内见大小不等脂滴，小泡性脂滴＞大泡性脂滴，肝细胞体积增大，肝索排列紊乱，炎性细胞浸润明显。造模8周时，肝细胞结构紊乱，肝细胞内出现大量脂滴，以大泡性脂肪病变为主，呈重度脂肪肝变，见少量纤维增生。造模10周时，肝细胞气球样变，呈重度脂肪肝变，肝细胞肥大，肝索排列紊乱，肝血窦狭窄甚至消失，并伴肝细胞点状坏死，见明显的纤维增生。

2.4 两组大鼠Wnt3α、β－catenin、Col1α1 mRNA表达比较 如表2及图3所示，经统计各组之间Wnt3α、β－catenin、Col1α1 mRNA表达有显著差异（F值为10.268，12.161，10.694，P＝0.000）。与空白组比较，模型组6week、8week、10week组Wnt3α mRNA表达增高（P＝0.011，0.001，0.000），模型组8week、10week组β－cateninmRNA表达增强（P＝0.001，0.000），模型组6week、8week、10week组Col1α1 mRNA表达显著增高（P＝0.023，0.007，0.000）；与模型组4week组比较，模型组8week、10week组Wnt3αmRNA表达增高（P＝0.012，0.011），β－catenin mRNA表达亦增强（P＝0.005，0.000），模型组10week组Col1α1 mRNA表达显著增高P＝0.000）。

表2 两组大鼠Wnt3α、β－catenin、Col1α1 mRNA表达比较（±S，n＝4）

表2 两组大鼠Wnt3α、β－catenin、Col1α1 mRNA表达比较（±S，n＝4）

与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组4w比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

组别 Wnt3αβ－catenin Col1α1空白组0.16±0.09 0.37±0.05 0.14±0.06模型组4w 0.24±0.09 0.40±0.07 0.20±0.11模型组6w 0.35±0.10* 0.45±0.08 0.28±0.06*模型组8w 0.42±0.08**＃ 0.56±0.13**＃＃ 0.31±0.06**＃模型组10w 0.54±0.11**＃＃ 0.66±0.07**＃＃ 0.47±0.12**＃＃F值 10.268 12.161 10.694（P）（0.000）（0.000）（0.000）

图3 两组大鼠Wnt3α、β－catenin、Col1α1 mRNA表达比较（A.空白对照组；B.造模4周；C.造模6周；D.造模8周；E.造模10周）

3.讨论

由于非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）发病率逐年上升，1/3的美国成年人有NAFLD［6］，欧洲的患病率为20%～30%［7］，中国为5%～24%［8］，印度城市人群为16%～32%［9］，这引起越来越多的研究者的关注。建立适当的、与人类相似的该疾病动物模型，是研究NAFLD的关键问题。目前，复制NAFLD动物模型的方法有很多，如高脂饲料饲喂、脂肪乳灌胃、高糖高脂饲料饲喂、复合因素诱导以及特殊品系的先天性遗传性模型等［10］。

Wnt是一种分泌型糖蛋白，富含半胱氨酸残基，主要通过自分泌或旁分泌的方式激活膜受体而发挥作用，Wnt信号通路活化的重要起始信号是Wnt蛋白表达。在进化过程中Wnt蛋白表达高度保守，并在多种组织细胞中均有表达。有研究发现经过Wnt3α处理的HSC表达α-SMA（α平滑肌肌动蛋白）及I型胶原上调，活化HSC而进一步加速肝纤维化［11］；siRNA沉默HSC－T6细胞β-catenin表达，使得Ⅰ、Ⅲ型胶原的分泌减少，从而延缓肝纤维化的发展［12］；用HINT1（TGF-β/Smad和Wnt/βcatenin通路的共同抑制剂）干预家兔肝纤维化模型，发现H1NT1可增强Smad7的基因表达，降低Smad3和cyclin D1的基因表达水平，阻抑肝脏组织中α-SMA的表达而延缓肝纤维化进程［13，14］。

我们采用脂肪乳灌胃的方法制备NAFLD模型，相对于高脂饲料饲喂模型有能按体重准确控制脂肪乳饲喂量的优势。本模型在第6W时肝指数开始显著增高（P＜0.05），TC在4周时显著增高（P＜0.05），TG与LDL-C在第8W时显著增高（P＜0.01）；病理结果显示，在4W时呈现轻度脂肪肝变，6W时呈中度脂肪肝变，8W时为重度脂肪肝变伴少量纤维化，10W时重度脂肪肝伴纤维化。纤维化程度随造模时间延长而加深，同时，Wnt/β-catenin信号通路中，起始信号Wnt3α基因，关键点βcatenin基因及下游靶基因Col mRNA表达增强，说明本模型Wnt经典信号通路启动并介导了纤维化的形成，通路中具体哪些因子参与介导还需要更进一步细致的研究。

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Effect of hepatic fibrosis and expression of Wan signaling pathway total gene in rats w ith nonalcoholic fatty liver disease by fat emulsion

YANGWen-qiang1，ZHONG Xin-sheng2，YANG Jia-yao3*etal.1.The center Laboratory，the No.1 Hospital of WuHan，（Wuhan Hubei，430030）China

Objectiue To establish the ratmodel of nonalcoholic fatty liver disease（NAFLD）by fat emulsion lavaged.M ethods：Twenty wistar ratswere randomly divided into two groups：model group（sixteen rats）were fed with fat emulsion（25%lard，10%cholesterol，1%acrylic，2%sodium deoxycholic acid）by 10ml/kg dose，control group（four rats）were fed with normal saline by the same dose.Four rats were selected from model group randomly in the fourth，sixth，eighth，tenth week and drew blood after weighted，anaesthetized to detectbiochemical indicators.Frozen section of liver tissue was stained by oil red O，paraffin section of liver tissue was stained by HE，and observed in themicroscopic，scored according to NAS（NAFLD activity scores），and the expression ofWnt3α，β-catenin，Col1a1 mRNA were detected at different time points.Results ①Biochemical results showed that compared with control group，T-Chol（total cholesterol）began to increase significantly（P＜0.01）in 4 weeks，TG（triglycerides），LDL-C（Low density lipoprotein cholesterol）began to increase significantly（P＜0.05）in 8 weeks.②Pathologic results showed thathepatic cell swelling，mild fatty liver in 4 weeks.Liver index began to increase significantly（P＜0.05）in 6 weeks，and itwas degreed ofmoderate fatty liver.Liver cells appeared a large number of lipid droplets（big bubble），severe fatty liver and fibrous hyperplasia was found in 8 weeks.In 10 weeks，all of liver index increased，there was hepatocyte ballooning change with dot necrosis，obvious hyperplasia of fibre.③Gene detection results showed that theWnt3 alpha，beta-catenin，Col1 alpha 1mRNA expression increased significantlywith the prolongation ofmodeling time.Conclusion Classic Wnt signal pathwaymediated the liver fibrosis process induced by fat emulsion lavage in thismodel，and Severe fatty livermodelwasmade by filling stomach fatmilk in 8 weeks，liver fibrosis occurred in 10 weeks.

Nonalcoholic fatty liver disease（NAFLD）；fat emulsion；ratmodel；β-catenin

2017－04－10 编辑：黄育华）

10.3969/j.issn.1005－0264.2017.03.014

2013年全国名老中医药专家传承工作室建设项目——杜建民工作室， △通讯作者，E－mial：54014317＠qq.com，Tel：18571775557