甲状腺乳头状癌中B-raf基因V600E突变的检测方法对比分析

阳 宇，杜晓华，刘 影，郑细闰，郑广娟

甲状腺乳头状癌中B-raf基因V600E突变的检测方法对比分析

阳 宇，杜晓华，刘 影，郑细闰，郑广娟

甲状腺肿瘤；乳头状癌；B-raf；V600E

甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，女性多于男性，约90%甲状腺癌为甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)[1]。近年，甲状腺癌的发病率呈上升趋势，B-raf基因与PTC密切相关，最多见的突变位点为V600E，是目前分析和检测的热点[2]。本文回顾性分析136例PTC的B-raf基因V600E突变，并采用免疫组化Ventana BenchMark法和RT-PCR法进行检测，分析两种方法的一致性，探讨在未能开展基因检测的医院单独行免疫组化法检测的可行性和必要性。

1 材料与方法

1.1材料选取2016年4月～11月广东省中医院病理科诊断的136例PTC组织，所有标本均同步行B-raf基因V600E突变的免疫组化法染色和RT-PCR检测。

1.2试剂DNA提取试剂盒(广州宝创公司)；人类B-raf基因V600E突变检测试剂盒(武汉海吉力公司)；超微量分光光度计ND-8000(Thermo Scientific公司)；RT-PCR检测仪(ABI公司)。石蜡包埋组织切片机、全自动染色机(Leica公司)；罗氏诊断B-raf V600E(VE1)抗体；全自动免疫组化仪(Ventana BenchMark)。

1.3方法

1.3.1免疫组化染色 常规2～3 μm厚切片，运用Ventana BenchMark全自动免疫组化仪进行检测；一抗选用罗氏诊断B-raf V600E(VE1)抗体，阳性判读标准为肿瘤细胞胞质着色，并设有阴阳性对照。

1.3.2RT-PCR 通过病理诊断选取肿瘤细胞富集的蜡块进行常规切片，4 μm厚切片，合计10张。采用Biotron DNA提取试剂盒进行提取DNA，并应用ND-8000超微量分光光度计对提取的DNA进行浓度及质量测定，其符合标准为1.7

2 结果

2.1RT-PCR与免疫组化法染色检测PTC经RT-PCR检测内参基因扩增的同时，B-raf目标基因与阳性对照也扩增，而阴性对照无扩增(图1)。免疫组化Ventana BenchMark法染色结果显示，PTC肿瘤细胞胞质经DAB染色呈棕色，细胞核经苏木精染色呈蓝色(图2)。

图1 RT-PCR检测B-raf基因V600E突变

黑色为检测标本目标基因，蓝色为内参，红色为阳性对照，绿色为阴性对照

图2免疫组化检测B-raf基因V600E突变：B-raf基因V600E突变在PTC肿瘤细胞胞质呈棕色，细胞核蓝染，Ventana BenchMark法

2.2RT-PCR与免疫组化染色分析两种方法检测的阳性率均为83.82%(114/136)，其中两种方法检测的阳性符合率为99.1%(113/114)，阴性符合率为95.5%(21/22)。另外，免疫组化染色阳性而RT-PCR阴性1例；免疫组化染色阴性而RT-PCR阳性1例(表1)。

表1 免疫组化和RT-PCR检测BRAF V600E突变分析

3 讨论

PTC中B-raf基因V600E突变的检测对乳头状不典型增生的鉴别诊断有较好的指导作用[3]，也与临床手术切除范围、治疗及预后密切相关[4-5]。因此，对其检测非常必要。RT-PCR法是目前B-raf基因V600E位点突变应用较广泛的检测技术，其检测灵敏性和特异性均高于免疫组化法。本实验对RT-PCR和免疫组化染色法结果进行分析，两者结果的阴、阳性符合率均较高，但仍有2例不符合。作者对2例不符合病例进行深入分析，发现其中1例免疫组化染色阴性标本，当时在做免疫组化染色时未设阳性对照，其阴性的真实性值得推敲。对该标本进行第2次免疫组化染色，设置阳性对照，结果显示B-raf基因V600E突变，与RT-PCR阳性结果一致。另1例免疫组化染色小灶阳性的标本因为色素的影响，导致病理医师误判为小灶阳性，经RT-PCR检测确定其阴性。结果修正判读后，免疫组化染色结果与RT-PCR检测结果符合率达100%，与中国医学科学院肿瘤医院应建明教授团队的研究结果高度一致[6]。

综上所述，RT-PCR法检测PTC的B-raf基因V600E突变结果稳定，是临床检测的首选方法；免疫组化染色由于特异性和灵敏性均较低，可能会对检测结果产生偏差；但只要在检测过程中避免影响免疫组化染色非特异性的因素，并选取正确的阳性对照，其对于未能开展分子检测的病理科或实验室也是较好的初筛工具，对PTC的预后和治疗均有一定的指导作用。

[1] 李小强，张惠箴，蒋智铭，等. 甲状腺乳头状癌中BRAF基因的表达及意义[J]. 临床与实验病理学杂志, 2012,28(9):991-995.

[2] 黄 伟，吴高松. 甲状腺癌相关BRAF基因研究的新进展[J]. 中国普通外科杂志, 2010,19(5):559-563.

[3] 张 翼，李 惠，陈 劼，等. BRAF基因突变检测在甲状腺乳头状病变中的临床意义[J]. 中外医疗, 2014,33(9):15-17.

[4] Eloy C, Santos J, Soares P,etal. The preeminence of growth pattern and invasiveness and the limited influence of BRAF and RAS mutations in the occurrence of papillary thyroid carcinoma lymph node metastases[J]. Virchows Archiv, 2011,459(3):265-276.

[5] Xing M, Alzahrani A S, Carson K A,etal. Association between BRAF V600E mutation and mortality in patients with papillary thyroid cancer[J]. JAMA, 2013,309(14):1493-1501.

[6] Qiu T, Lu H, Guo L,etal. Detection of BRAF mutation in Chinese tumor patients using a highly sensitive antibody immunohistochemistry assay[J]. Sci Rep, 2015,5:9211.

时间：2017-7-18 11:52 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1152.029.html

广东省中医院病理科，广州 510120

阳 宇，男，硕士，医师。Tel:(020)39318331，E-mail：729195014@qq.com 郑广娟，女，教授，主任医师，通讯作者。E-mail：zhengguangjuan@163.com

R 394-33

:B

1001-7399(2017)07-0815-02

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.029

接受日期：2017-05-26