利用孔雀绿-磷钼杂多酸分光光度法测定水样中微量磷酸盐

朱靖蓉,温云杰,宋书会 ,马 磊,张金尧 ,汪 洪

(1.新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,乌鲁木齐 新疆830091;2.中国农业科学院农业资源与农业区划研究所/耕地培育技术国家工程实验室/农业部植物营养与肥料重点实验室 北京100081)

利用孔雀绿-磷钼杂多酸分光光度法测定水样中微量磷酸盐

朱靖蓉1,温云杰2,宋书会2,马 磊1,张金尧2,汪 洪1

(1.新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,乌鲁木齐 新疆830091;2.中国农业科学院农业资源与农业区划研究所/耕地培育技术国家工程实验室/农业部植物营养与肥料重点实验室 北京100081)

【目的】磷钼蓝分光光度法是水中磷酸盐含量的常用检测方法，但不适用于磷酸盐含量低(<0.04 mg/L)的水样。建立一种更准确的水中微量磷酸盐检测方法。【方法】对孔雀绿-磷钼杂多酸分光光度法中最大吸收波长、显色剂中孔雀绿和浓硫酸的比例与用量、表面活性剂聚乙烯醇(PVA)用量、显色稳定时间等指标依次优化，选择1个湖水样品和系列低浓度磷标准溶液，用优化后的测定方法进行方法回收率、精密度和检出限研究。【结果】优化后的关键点是最大吸收波长620 nm，显色剂配制比例钼酸铵溶液(176.5 g/L)/孔雀绿溶液(11.2 g/L)/浓硫酸=40/32/34(体积比)，显色体积中显色剂比例占8%，显色稳定时间30 min，方法检出限为1.2 g/L，磷(P)浓度小于10.00μg/L时相对标准偏差RSD 8.3%～9.1%，P浓度大于10.00μg/L时RSD小于5%，加标回收率在97.0 %～108.2 %。【结论】优化后的孔雀绿-磷钼杂多酸分光光度法检测限低，灵敏度高，线性范围宽，显色溶液稳定，准确度、精密度符合水质测定需求，操作简便，适合环境中水体微量磷酸盐含量的检测。

孔雀绿；分光光度法； 磷酸盐； 水

0 引 言

【研究意义】人类活动和自然因素导致磷素进入湖泊、水库造成水体富营养化已经是一个严重的环境问题[1-3]。磷酸盐被认为是水生植物过量生长的关键因素之一，水中磷酸盐的含量是评价水质的重要指标[4]。磷钼蓝分光光度法是目前水样中磷酸盐含量测定的常用方法，但该法络合物稳定时间短，检测限高，灵敏度低，不适于水样中微量磷的测定。《地表水环境质量标准》(GB 3838-2002)规定我国III类水的水体中总P浓度临界指标是0.2 mg/L，湖泊和水库中总P浓度临界指标是0.05 mg/L。因此研究水中微量磷酸盐含量(低于0.04 mg/L)的检测方法，是评价水质、对水体污染进行早期预警的关键[4]。【前人研究进展】水中磷酸盐含量的分析方法有分光光度法、重量法等化学方法，离子色谱、ICP-AES、电极电位等仪器分析方法也在快速普及[5-8]。分光光度法是经典测定方法，在水样中磷酸盐含量分析时仍起着不可替代的作用。其中的磷钼蓝分光光度法是目前水样中磷酸盐含量测定的常用方法，其中《水质总磷的测定 钼酸铵分光光度法》(GB 11893-89)[9]此标准适用于地面水、污水和工业废水，最低检出浓度为0.01 mg/L，测定上限为0.6 mg/L。《水质 磷酸盐和总磷的测定 连续流动-钼酸铵分光光度法》(HJ 670-2013)[10]当检测光程为50 mm时，方法检出限(以P计)为0.01 mg/L，测定范围为0.04～1.0 mg/L。这个方法测定磷的含量范围能满足判定水质是否符合《地表水环境质量标准》(GB 3838-2002)规定的我国III类水的水体中总P浓度临界指标0.2 mg/L、湖泊和水库中总P浓度临界指标0.05 mg/L。但磷钼蓝分光光度法测定磷酸盐的缺点是灵敏度不够高，对于水中微量磷(低于0.04 mg/L)的检测难以应用[6,7,11-13]，这对于研究水体中磷的积累过程、进行早期预警是不利的。【本研究切入点】孔雀绿-磷钼杂多酸分光光度法的原理是在酸性条件下，碱性染料孔雀绿与磷钼杂多酸生成绿色离子缔合物，同时以聚乙烯醇稳定显色液，直接用分光光度计测定。它可用于水中低含量浓度范围磷的检测，但显色剂的配制方法和用量、孔雀绿的溶解过程、表面活性剂用量和最大吸光度波长等关键内容尚无明确结论[14-18]。研究建立一种更准确的水中微量磷酸盐检测方法。【拟解决的关键问题】研究孔雀绿磷钼杂多酸分光光度法中关键环节技术条件变化对水中微量磷测定值的影响，评价其准确度和精密度，建立一种水中微量磷酸盐检测方法。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试剂

浓硫酸、钼酸铵、孔雀绿、聚乙烯醇(PVA)、 磷酸二氢钾均为分析纯。水为去离子水，符合GB/T6682二级水的规定。

1.1.2 仪器

紫外可见分光光度计(岛津 UV-2700)、精密分析天平(精确至0.1 mg)、超纯水系统(阻抗18.02MΩ·cm)。

1.2 方 法

1.2.1 溶液配制

钼酸铵溶液(浓度176.5 g/L)：溶解176.500 g钼酸铵于水中，稀释定容至1 000 mL；孔雀绿溶液(浓度11.2 g/L)：加热溶解5.600 g 孔雀绿于水中，稀释定容至500 mL；1%聚乙烯醇(PVA)溶液：加热溶解10.000 g PVA于水中，冷却，稀释定容至1 000 mL，经滤纸过滤备用；钼酸铵:浓硫酸:孔雀绿=40:32:34(体积比/mL)显色剂：浓硫酸和孔雀绿溶液依次缓慢加入钼酸铵溶液中，混匀后冷却，经滤纸过滤备用，避光贮藏；100 mg/L磷标准储备溶液：溶解 0.219 7 g磷酸二氢钾(105℃下烘干2 h)于水中，定容至500 mL，临用前稀释至所需浓度。

1.2.2 优 化

准确吸取1.0 mg/L磷标准使用液1.0、1.5、2.0 mL于25 mL比色管中，依次加入2.00 mL显色剂及1.00 mL 1% PVA溶液，摇匀，用水定容，室温放置30 min，在400 ～700 nm波长处扫描测定吸光度，得到最大吸收波长。选择特征波长620 nm，依次对显色剂比例与用量、表面活性剂PVA用量，显色稳定时间等指标优化。选择1湖水样品和系列低浓度磷标准溶液，用优化后的测定方法进行方法回收率、精密度、检出限等。

1.2.3 标准曲线

用1.0 mg/L磷标准溶液配制0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/L磷标准梯度溶液，按1.2的条件测定，以空白溶液为参比，于620 nm波长处测吸光度。以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线并计算回归方程。标准曲线方程为Y=3.485 9X-0.007 96(R2=0.999 1)。

1.3 数据处理

每个样品平行测定6次，样品中磷含量用P元素的质量分数表示。6次测量值pi的算术平均值为样品中磷的估计值，即测量结果，并计算相对标准偏差(RSD)。

2 结果与分析

2.1 吸收波长与吸光度关系

在0.04、0.06和0.08 mg/L的标准磷溶液中，加入按文献[15-18]常用比例配制的显色剂(钼酸铵/孔雀绿/浓硫酸=40/35/35，体积比)2.00 mL，在400～700 nm波长内，分别扫描溶液的吸光度，吸光度均在620 nm处达到最大，因此实验测定波长选择620 nm。虽然有研究发现绿色缔合物与空白的吸光度差值在580 ～680 nm较大，在660 nm处最大[17]。图1

图1 孔雀绿-磷钼杂多酸分光光度法测定不同磷浓度标准溶液的吸收光谱

Fig.1 The MG colorimetric method of determinate absorption spectra of different phosphorus concentrations

2. 2 显色剂配比对吸光度的影响

孔雀绿用量和溶液酸度对孔雀绿磷钼杂多酸显色反应影响较大，在已有文献中显色剂配制比例均有差异[15-18]。试验中设计了由不同比例孔雀绿和硫酸配制的显色剂，通过比较吸光度选择合适的孔雀绿与硫酸用量。

以40 mL钼酸铵溶液和32 mL孔雀绿溶液为基液，再添加不同体积硫酸溶液，配制成不同酸度的显色剂，分别吸取2.00 mL加入到0.1 mg/L磷标准溶液中，按1.2步骤，在620 nm波长处测定吸光度。研究表明，当硫酸用量为32～36 mL时，显色反应吸光值较大，也较稳定。

以40 mL钼酸铵溶液和34 mL浓硫酸为基液，加入不同体积孔雀绿溶液，配制成颜色不同深度的显色剂，加入0.1 mg/L磷标准溶液中，按1.2步骤，在620 nm波长处测定吸光值。加入的孔雀绿溶液为34 mL时吸光值最高，加入量在32～38 mL之间吸光值并无显著变化。图2

确定显色剂配比为：钼酸铵溶液(176.5 g/L)/孔雀绿溶液(11.2 g/L)/浓硫酸=40/36/34(体积比)。

图2 不同硫酸和孔雀绿用量的显色剂下相同浓度磷溶液吸光度

Fig. 2 The absorbance of different amount of sulfuric acid and malachite green

2. 3 显色剂用量的确定

在0.1 mg/L的磷标准溶液中，分别加入按2.2方法配制的显色剂1、1.5、2、2.5、3、3.5 mL，及1 mL PVA试剂，定容至25 mL。在620 nm测定吸光度分别是0.268、0.309、0.345、0.344、0.335、0.315。显色剂用量2和2.5 mL时吸光度最大，最终确定显色剂用量为2 mL，即显色体积中显色剂比例占8%。

2.4 聚乙烯醇(PVA)用量对吸光度的影响

PVA是表面活性剂，作用就是作为增敏剂与增溶剂，通过疏水作用，在酸性条件下磷钼杂多酸与孔雀绿发生化学反应时，使孔雀绿分子与磷钼杂多酸更好的结合，生成稳定的绿色离子缔合物。在5 mL的0.1 mg/L的磷标准溶液中，加入2 mL按2.2方法配制的显色液，分别加入0.5、1、1.5、2、2.5 mL的PVA试剂，定容至25 mL，测定吸光度分别为0.311、0.342、0.335、0.339、0.340。表明PVA用量对吸光度影响不大。

2. 5 显色时间与磷酸缔合反应的关系

在各5 ml的0.10、0.20 mg/L的磷标准溶液中，加入2.0 mL按2.2方法配制的显色剂和1 mL PVA溶液，定容至25 mL后，在显色10 min到12 h之间的9个显色时间后，在620 nm迅速测定吸光度。发现在显色30 min后，两个浓度磷溶液的吸光度达到最大，随着显色时间增长吸光度再没有明显增大。说明30 min后磷酸缔合反应基本完成，并且磷酸缔合物稳定时间较长，至少可达12 h。图3

图3 不同显色时间的磷溶液吸光度

Fig. 3 Theabsorbance of different color-developing time

2. 6 方法准确度、精密度和检出限

采用优化后的测定方法，即分别在湖水样、5.0、10.0、60.0、100 μg/L磷标准液，以及湖水样+10.00、湖水样+20.00、湖水样+60.00 μg /L磷标准液中，加入2 .0 mL显色剂和1.0 mL PVA溶液，显色30 min，在620 nm波长处测定吸光值。结果表明，无论是磷标准溶液，还是加入磷标准液的湖水样，所测的回收率均在97.0 %～108.2 %之间。溶液磷浓度小于10 μg /L时，测定值的相对标准偏差RSD在8.3%～9.1%；大于10 μg/L时RSD则小于5 %。显然方法的准确度、精密度符合水质监测需求。表1

3 讨 论

表1 优化方法测定的相对标准偏差和回收率(n=6)

Table. 1 The relative standard deviation and recovery rate of the optimized test method(n=6)

处理TreatmentsP平均值(μg/L)MeasuredPvalue相对标准偏差RSD(%)回收率(%)Recoveryrate湖水样24．5±1．87．4/湖水+10．00μg/LP标准溶液35．1±1．54．3106．0湖水+20．00μg/LP标准溶液43．9±1．22．797．0湖水+60．00μg/LP标准溶液85．4±1．11．3101．55．00μg/LP标准溶液5．50±0．59．1108．2%10．00μg/LP标准溶液10．80±0．98．3108．1%60．00μg/LP标准溶液59．3±2．13．598．8%100．00μg/LP标准溶液101．1±2．12．1101．1%

注：测定值为平均值±标准方差(n=6)

按照国际应用化学联合会(IUPAC)检出限测定方法[19,20]，用空白试剂进行了12次重复测定，试剂空白平均值3.2 μg/L，标准方差(SD)为0.0004，检出限MLD=3×SD=1.2 μg/L。这个检出限远小于《水质 磷酸盐和总磷的测定 连续流动-钼酸铵分光光度法》标准(HJ 670-2013)[13]和《水质总磷的测定 钼酸铵分光光度法》标准(GB 11893-89)[12]的检出限0.01 mg/L(10 μg/L)，也小于《水质磷酸盐的测定 离子色谱法》标准(HJ 669-2013)[8]的检出限7μg/L。

4 结 论

对孔雀绿-磷钼杂多酸分光光度法关键技术条件优化后，检出限低至1.2 μg/L，灵敏度高，线性范围宽，显色溶液稳定时间长，准确度、精密度符合水质监测需求，操作简便，可用于水中微量磷酸盐含量的测定；优化后的关键条件是：显色剂按钼酸铵(176.5 g/L)/孔雀绿(11.2 g/L)/ 浓硫酸=40/32/34(体积比)配制，显色剂用量2.0 mL，1%聚乙烯醇(PVA)溶液1.0 mL，显色30 min，在620 nm波长处测定吸光度。

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Determinationofphosphateinwaterbythecomplexesofmalachitegreen-phosphomolybdatespectphotometry

Zhu Jing-rong1,Wen Yun-jie2,Song Shu-hui2, Ma Lei1, Zhang Jin-yao2, Wang Hong2

(1.InstituteofQualityStandards&TestingTechnologyforAgro-products,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences，Urumqi830091，China;2.NationalEngineeringLaboratoryforImprovingQualityofArableLand/KeyLaboratoryofPlantNutritionandFertilizer，MinistryofAgriculture/InstituteofAgriculturalResourcesandRegionalPlanning,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081，China)

【Objective】 Phosphorus molybdenum blue spectrophotometry is a commonly used method for the determination of phosphate in water, but it is not suitable for low concentration (<0.04 mg / L). This paper attempts to establish a more accurate method for the determination of trace phosphate in water. 【Method】 The maximum absorption wave length, the ratio and amount of malachite green and concentrated sulfuric acid in the colorant, the amount of PVA, the color stability time and so on were optimized in the range of the maximum absorption wave length of the malachite green-phosphomolybdate heteropoly acid spectrophotometry. The recovery rate, precision and detection limit of the optimized method were studied using a lake sample and a series of low concentrations of phosphorus standard solution.【Results】 The maximum absorption wavelength was 620 nm, the volume ratio of ammonium molybdate(176.5 g/L)/sulfuric acid(11.2 g/L)/malachite green was 40/32/34 in chromogenic agent. The proportion of color reagent in color development accounted for 8%, PVA 4%. Color stability time was up to 12 h. The detection limit was 1.2 μg/L, the relative standard deviation RSD was in the range of 8.3% -9.1% when the phosphorus concentration was less than 10.00 μg / L, and the RSD was less than 5% when the P concentration was more than 10.00 μg/L. The recovery rate was in the range of 97.0%-108.2%. 【Conclusion】The modified malachite green-phosphomolybdate heteropoly acid spectrophotometric detection limit is low, the sensitivity is high, the linear range is wide, the color solution is stable, the accuracy and precision meet the water quality requirement, and the operation is simple and suitable for the microphosphate content of the detection.

malachite green (MG); spectphotometry; phosphate; water sample

Wang hong(1970- ), male, native place: Anhui. Professor, Ph.D.,research field: Study on crop nutrition and detection technology. (Email) wanghong01@caas.cn*

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.08.023

2017-04-15

国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2013CB127402)

朱靖蓉(1972-)，女，浙江人，高级实验师，硕士，研究方向农产品质量安全与检测技术, zhujr2030@163.com

汪洪(1970-)， 男，安徽人， 研究员，博士，研究方向作物营养与检测技术，wanghong01@caas.cn

S19

：A

：1001-4330(2017)08-1559-07

Supported by: The Major State Basic R & D Program of China (973 Program) (2013CB127402)