甘蓝型油菜含油量性状的QTL定位

王燕惠，顾元国，范李萍，段雅洁，高文伟，曲延英，陈跃华

(1.新疆农业大学农学院/新疆农业大学农业生物技术试验室，乌鲁木齐 830052；2.新疆农业科学院经济作物研究所，乌鲁木齐 830091)

甘蓝型油菜含油量性状的QTL定位

王燕惠1，顾元国1，范李萍1，段雅洁1，高文伟1，曲延英1，陈跃华2

(1.新疆农业大学农学院/新疆农业大学农业生物技术试验室，乌鲁木齐 830052；2.新疆农业科学院经济作物研究所，乌鲁木齐 830091)

【目的】开发与含油量相关的分子标记，发掘与该性状相关的基因。【方法】以Springfield-B和ymnm-8作为亲本构建F2群体，利用SRAP分子标记构建甘蓝型油菜遗传连锁图谱。【结果】该遗传图谱含有52个标记位点，图谱全长1 039.6 cM，含有15个连锁群，标记间的平均遗传距离为19.9 cM。分析与含油量相关的QTL位点，获得了2个与含油量相关QTL位点。其中qOC1位于连锁群LG1:EM9ME6-EM17ME24标记区，qOC15位于连锁群LG1: EM3ME5-EM4ME22a标记区间，其表型变异解释率分别为11.23%和4.12%，加性效应值分别为0.48和3.56。【结论】获得了2个与含油量相关QTL位点，为研究甘蓝型油菜含油量奠定了一定的基础。

甘蓝型油菜；含油量；遗传连锁图谱；QTL定位

0 引 言

【研究意义】油菜作为世界主要食用油作物，同时是我国第一大油料作物，为我国食用油的主要来源[1]。甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)为主要油菜育种栽培类型，许多学者提出其主要育种目标为“双低一高”，“一高”指的就是高产量、高含油量。甘蓝型油菜含油量是有多基因控制的数量遗传性状，且环境因素影响较大，常规育种手段很难达到育种目标[1]。随着分子标记技术在作物育种中的应用，甘蓝型油菜含油率研究进入分子水平。【前人研究进展】研究发现，高含油量亲本对选育高含油量品系至关重要，陈玉峰[2]利用分子标记技术，对我国高含油量油菜种质资源进行分析，从中挑选出22个双亲含油量均大于45.0%、均为双低且亲本之间遗传距离大于0.5。张洁夫等[3]利用BC1 F1 为作图群体，构建了由19 个连锁群组成的分子标记遗传图谱，进行甘蓝型油菜QTL定位扫描，发现其含油量由1对加性-显性主基因+加性-显性-上位性多基因控制，同时定位出5 个与含油量相关的QTL位点。万成燕[4]综合利用SSR、RAPD和SRAP三种分子标记构建出一张分子标记遗传图谱，检测到了2个与含油量相关的QTL位点。有学者自主开发了一批甘蓝型油菜GSS-SSR标记，并将其用于构建遗传连锁图，检测到了一系列控制含油量的QTLs[5,6]。孙美玉[7]对甘蓝型油菜含油量QTLs定位及候选基因筛选，共检测到17个QTLs。通过QTL定位，每个QTL解释含油量表型变异是9.15%～24.56%，结合差异表达基因，共得到了7个含油量候选基因。【本研究切入点】有关引不同遗传背景的甘蓝型油菜含油量相关QTL定位鲜见报道，为进一步研究控制含油量的相关基因，研究以来源于加拿大高含油量材料为母本，以来源于我国内蒙古低含油量材料为父本， F2代为作图群体，利用480对SRAP引物构建分子标记遗传图谱。【拟解决的关键问题】通过对遗传背景差异较大的甘蓝型油菜含油量进行QTL定位，进一步确定影响含油量的相关基因，为提高其含油量奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

参试品种母本为Springfield-B母本，来源于加拿大，含油量48.51%，父本ymnm-8，来源于我国内蒙古，含油量23.70%。于2014年4月至2015年7月在新疆农科院安宁渠试验场进行，收获F2代，于2015年10月海南试验基地种植F2代， 共132棵单株，苗期取单株幼嫩叶片，采用CTAB法提取样品DNA，于-20°C冰箱保存备用。

1.2 方 法

1.2.1 引物序列及条带统计

参考G. Li 、 M. Gao[8]公布的SRAP引物，共480对引物，对供试品种DNA进行扩增，对清晰、稳定的扩增条带记为1，无带的记为0，缺失的记为-1。

1.2.2 PCR反应体系及反应程序

列出PCR反应体系及扩增程序。表1，表2

1.3 数据处理

1.3.1 F2群体含油量的平均值、变异系数及变异范围

利用SAS8.1软件(SAS Institute Inc., Cary, NC,USA)分析F2群体油菜含油率的平均值、变异系数及变异范围。

表1 PCR扩增反应体系

Table 1 PCR amplification reaction system

试剂Reagent体积Volume(μl)10×TaqBuffer(含Mg+)1 0dNTP(10mmol/L)0 8TaqDNAPolymerase(0 1U/μL)0 1引物Primer(10μmol/L)0 8DNA模板(60ng/μL)1 0ddH2O6 3

表2 PCR反应程序

Table 2 PCR reaction procedure

过程Process温度Temperature时间Time预变性Predenaturation94℃4min变性Denaturation94℃(5个循环)1min退火Annealing35℃(5个循环)45s延伸Extend72℃1min变性Denaturation94℃(35个循环)1min退火Annealing50℃(35个循环)45s延伸Extend72℃1min延伸Extend72℃10保存4℃

1.3.2 数据处理

利用SAS8.1软件(SAS Institute Inc., Cary, NC,USA)分析F2群体油菜含油率的平均值、变异系数及变异范围。其中母本记为2，父本记为0，F1记为1，缺失记为了1，F2分别记为2/0/1/-1。

1.3.3 分子遗传图谱的构建及含油量的QTL定位

利用QTL作图软件QTL IciMapping Version3.2进行遗传连锁图谱绘制。设定LOD值为3.0，最大遗传距离50 cm的情况下，通过复合区间法对甘蓝型油菜含油量性状进行QTL定位。并计算各个标记对表型能够解释的变异值和遗传效应值。

QTLs命名方法按照英文字母“q+性状名称的缩写+连锁群号”表示，性状和连锁群号之间加“-”隔开，同一染色体的不同QTL则在染色体名称后加1、2等区分。

2 结果与分析

2.1亲本及F2群体表型性状

研究表明，F2群体含油量均值38.12%、变幅23.81%～48.47%、变异系数22.35%， F2群体分离较大；对F2群体进行正态分布检验，F2群体含油率性状均成连续性变化，符合正态分布，且偏度与峰度的检验结果均小于1，说明该群体可进一步用于遗传图谱构建。表3，图1

表3 亲本及F2群体田间农艺性状表现

图1 含油率次数分布

Fig.1 Frequency distribution diagram of oil content

2.2 亲本间多态性筛选

试验利用220对SRAP引物对亲本进行多态性筛选，其中52对引物表现出多态性，共获得59个多态性位点，其中检测到2个分离位点的标记有5个，检测到3个分离位点的标记有2个，其余标记均检测到单个分离位点。图2，图3

2.3 绘制连锁图谱

以F2代为作图群体，利用QTL作图软件QTL IciMapping Version 3.2进行遗传作图，44个SRAP标记位于15个连锁群上，全长1 039.6 cM，标记间平均距离为23.63 cM。图4，表3

图2 亲本在不同SSR引物下的扩增图

Fig.2 Amplification map of parents under different SSR primers

图3 引物EM16ME13在群体部分单株扩增结果

Fig.3 Amplification of primer EM16ME13 in each plant population

图4 群体连锁图谱

Fig.4 Population linkage map

表3 遗传图谱标记在连锁群上的定位

2.4 标记基因型分离比例检测

按数据转化法将电泳带型转化为数据，统计基因型，利用卡方检验法检验位点分离比情况，52个多态性位点有10个偏离1∶2∶1的分离比例，占标记位点的19.20%。

2.5 含油量性状的QTL检测

运用QTL Icimapping v2.2的复合区间法对甘蓝型油菜含油量进行QTL分析，检测到2个与含油量相关的QTL位点。其中qOC1位于连锁群LG1: EM9ME6-EM17ME24，其贡献率为4.12%，加性效应值为0.48，qOC15位于连锁群LG1：EM3ME5-EM4ME22a(图3～4)，其贡献率为11.23%，其加性效应值为0.63。表4

表4 油菜含油量的QTL定位

Table 4 QTL location of oil content in rape

QTL连锁群Linkagegroup标记区间Markinterval位置Position加性效应AdditiveeffectLOD贡献率ContributionrateqOC1LG149 74EM9ME6-EM17ME240 482 324 12%qOC15LG1535 14EM3ME5-EM4ME22a0 633 5611 23%

3 讨 论

研究发现甘蓝型油菜含油率是多基因控制，且受环境因素影响较大[9-11]，研究发现，与甘蓝型油菜含油量相关的SRAP标记位于15个遗传连锁群上，通过QTL定位分析，2个QTI位点的贡献率为15.35%，加性效应高达0.63。与前人研究结果相似[12-14]，张书芬[15]通过对甘蓝型油菜含油率主基因+多基因遗传效应分析发现分离世代F2及F2∶3家系含油量次数分布均呈混合的正态分布，符合主基因+多基因的遗传特征，同时甘蓝型油菜含油量受非加性效应影响，高含油量杂交油菜育种应以一般配合力较高的亲本为主。

目前许多学者对油菜含油量进行QTLs定位，同时对相关基因进行筛选。进一步确定控制油菜含油量的主效基因，开发相关分子标记，在后代群体中进行筛选，避免环境因素造成的基因型丢失，更重要的是缩短育种年限。研究利用F2群体进行遗传连锁作图、QTL定位，44个SRAP标记位于15个连锁群上，全长1 039.6 cM，标记间平均距离为23.63 cM。王继变[16]以SGE群体为作图群，构建了一个全长为1 142.8 cM、标记间平均距离为6.68 cM的SGE甘蓝型油菜遗传连锁图谱，共有93个标记位点完全匹配。邵玉锁[17]分别用BC3F1群体、DH群体进行QTL定位，进一步确定了与含油量相关的QTL标记位于A7连锁群上，且标记直间约3 cM，在该区间存在控制油菜含油量基因可信度更高。研究仅仅只是在F2群体中进行初步定位，所用标记只有SRAP标记，要确定本次QTL定位的准确性，需要构建DH群体或BC3F1群体，利用更多的分子标记对遗传连锁图谱进行加密，确定所定位的准确性。

4 结 论

以高含油率Springfield-B作为母本、低含油率ymnm-8作为父本构建F2群体，建立遗传连锁图谱，分析与含油量相关的QTL位点，获得了2个与含油量相关QTL位点。其中qOC1位于连锁群LG1的EM9ME6-EM17ME24标记区间，标记对表型能够解释的变异值为4.12%，加性效应为0.48，qOC15位于连锁群LG1的EM3ME5-EM4ME22a标记区间，标记对表型能够解释的变异值为11.23%，其加性效应为0.63。

References)

[1] 蒲晓斌,蒋梁材,张锦芳,等.作物育种新技术:DNA标记辅助选择[J].种子，2006，(5):54-55.

PU Xiao-bin, JIANG Liang-cai, ZHANG Jin-fang. et al. (2006). New techniques for crop breeding: DNA marker assisted selection [J].Seed, (5):54-55.(in Chinese)

[2]陈玉峰. 高含油量甘蓝型油菜遗传多样性分析[C]//. 湖北省遗传学会.基因开启未来：新时代的遗传学与科技进步-湖北省遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编.湖北省遗传学会:2009.

CHEN Yu-feng. (2009).GeneticdiversityofBrassicanapuswithhighoilcontent[C]//. Genetics Society of Hubei ne opening future: genetics and technology progress in the new era: Proceedings of the Eighth Congress and Academic Symposium of Genetics Society of Hubei. Genetics Society of Hubei Province,1. (in Chinese)

[3]张洁夫,戚存扣,浦惠明,等. 甘蓝型油菜含油量的遗传与QTL定位[J]. 作物学报,2007,(9):1 495-1 501.

ZHANG Jie-fu, QI Cun-kou, PU Hui-ming, et al. (2007). CHEN Song. et al. Inheritance and QTL mapping of oil content in Brassica napus [J]JournalofCropScience, (9):1,495-1,501. (in Chinese)

[4]万成燕. 甘蓝型油菜含油量的遗传与QTL定位[D]. 雅安: 四川农业大学硕士论文,2011.

WAN Cheng-yan. (2011).InheritanceandQTLmappingofoilcontentinBrassicanapus[D]. Master Thesis. Sichuan Agricultural University, Ya'an. (in Chinese)

[5]曾细华. 甘蓝型油菜A10连锁群含油量主效QTL定位[D].武汉：华中农业大学硕士论文,2011.

ZENG Xi-hua. (2011).OilmajorQTLlocationoflinkagegroupA10aboutBrassicanapus[D]. Master Thesis. Huazhong Agricultural University of Huazhong, Wuhan. (in Chinese)

[6]程小毛. 甘蓝型油菜GSS-SSR标记开发及含油量QTL定位[D].武汉：华中农业大学博士论文,2009.

CHEN Xiao-mao. (2009).DevelopmentofGSS-SSRmarkersandQTLmappingofoilcontentinBrassicanapus[D]. PhD Thesis. Huazhong Agricultural University, Wuhan. (in Chinese)

[7]孙美玉. 甘蓝型油菜含油量QTLs定位及候选基因筛选[D].北京：中国农业科学院博士论文,2012.

SUN Mei-yu. (2012).OilseedQTLsmappingandcandidategenescreeninginBrassicanapus[D]. PhD Thesis. Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing. (in Chinese)

[8]Li, G., Gao, M., Yang, B., & Quiros, C. F. (2003). Gene for gene alignment between the brassica and arabidopsis genomes by direct transcriptome mapping.TheoreticalandAppliedGenetics, 107(1):168-180.

[9]金梦阳,刘列钊,付福友,等.甘蓝型油菜SRAP、SSR、AFLP和TRAP标记遗传图谱构建[J].分子植物育种,2006,4(4):520-526.

JIN Meng-yang, LIU Lie-zhao, FU Fu-you, et al. (2006). Construction of a Genetic Linkage Map in Brassica napus Based on SRAP, SSR, AFLP and TRAP [J].MolecularPlantBreeding, 4(4): 520-526. (in Chinese)

[10]蔡长春,林国平,王毅,等.利用DH群体对白肋烟烟碱含量进行遗传分析[C]//.湖北省烟草学会.湖北省烟草学会2007年学术年会论文集.湖北省烟草学会,2007:7.

CAI Chang-chun, LIN Guo-ping, WANG Yi, et al. (2007).GeneticanalysisofnicotinecontentinburleytobaccowascarriedoutbyDHpopulation[C]//. Hubei Tobacco Society. Proceedings of the 2007 Annual Academic Meeting of Hubei Tobacco Society . Hubei Tobacco Society: 7. (in chinese)

[11]Ivandic, V., Hackett, C. A., Nevo, E., Keith, R., Thomas, W. T. B., & Forster, B. P. (2002). Analysis of simple sequence repeats (ssrs) in wild barley from the fertile crescent: associations with ecology, geography and flowering time.PlantMolecularBiology, 48(5): 511-527.

[12]Delourme, R.，Falentin, C.，Huteau, V.，et al. (2006).Genetic control of oil content in oilseed rape (BrassicanapusL. ) .TheoreticalandAppliedGenetics，2006，113(7): 1,331-1,345.

[13]Yan, X. Y., Li, J. N., Fu, F. Y., Jin, M. Y., Chen, L., & Liu, L. Z. (2009). Co-location of seed oil content, seed hull content and seed coat color qtl in three different environments in brassica napus l.Euphytica, 170(3): 355-364.

[14]Ecke, W., Uzunova, M., & Wei?leder, K. (1995). Mapping the genome of rapeseed (Brassicanapus, L. ). ii. localization of genes controlling erucic acid synthesis and seed oil content.TheoreticalandAppliedGenetics,91(6): 972-977.

[15]张书芬，马朝芝，朱家成，等. 甘蓝型油菜含油量的主基因+多基因遗传效应分析(英文)[J]. 遗传学报，2006，(2)：171-180.

Zhang Shu-fen, Ma Chao-zhi, Zhu Jia-cheng, et al. (2006). Genetic analysis of oil content in Brassica napus L. using mixed model of major gene and polygene[J].ActaGeneticaSinica, (2):171-180.

[16]王继变，陈洪成，陈玉波，等. 通过条件QTL定位分析油菜不同脂肪酸组分对含油量性状的影响[J]. 浙江大学学报(农业与生命科学版)，2013，(5)：504-512.

WANG Ji-bian, CHEN Hong-cheng, CHEN Yu-bo, et al. (2013). The effects of different fatty acid components on oil content traits were analyzed by conditional QTL analysis[J].JournalofZhejiangUniversity(AgricultureandLifeScience), (5):504-512.

[17]邵玉锁,倪西源,黄吉祥,等. 利用BC_3F_1群体定位和分析甘蓝型油菜A7-含油量QTL[J]. 中国农业科学,2010,(1):20-28.

SHAO Yu-suo, NI Xi-yuan, HUANG Ji-xiang, et al. (2010). Location and analysis of A7- oil content inBrassicanapusL. by BC_3F_1 population QTL [J].ChineseAgriculturalScience, (1):20-28. (in Chinese)

MappingQTLsforOilContentTraitsinBrassicanapusL.

WANG Yan-hui1, GU Yuan-guo2, FAN Li-ping1, DUAN Ya-jie1, GAO Wen-wei1, QU Yan-ying1, CHEN Yue-hua2

(1.CollegeofAgronomy,XinjiangAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofAgricultureBiologicalTechnology,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China; 2.ResearchInstituteofEconomicCrops,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China)

【Objective】 To locate the molecular markers related to the oil and explore the genes related to the trait. 【Method】In this study, F2population was constructed with Springfield-B and ymnm-8 as parents, and SRAP molecular markers were used to construct the genetic linkage map ofBrassicanapusL. 【Result】The results showed that the genetic map contained 52 marker sites with a total length of 1,039.6 cM and 15 linkage groups. The average genetic distance between the markers was 19.9 cM. The QTLs associated with oil content were analyzed and two QTLs related to oil content were obtained. QOC15 was located in the linkage group LG1: EM3ME5-EM4ME22a, and the explanatory rates were 11.23% and 4.12%, respectively, and the additive effect values were 0.48 and 3.56, respectively. The qOC1 was located in the linkage group LG1: EM9ME6-EM17ME24. 【Conclusion】Two QTL loci related to oil content were obtained, which laid a foundation for the study of oil content inBrassicanapusL.

BrassicanapusL.; oil content; genetic linkage map; QTL mapping

GAO Wen-wei (1973-) male, native place:Shanxi, Professor, research field: Crop genetics and breeding. (E-mail)280594606@qq.com CHEN Yue-hua (1958-), male, Changji, Xinjiang ,Researcher，research field: Genetics, breeding and cultivation of rape，(E-mail)chenyuehua158576@sina.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.08.008

2017-06-05

自治区高技术研究发展计划“新疆甘蓝型春油菜分子标记辅助杂种培育技术应用”(201311109)

王燕惠(1989-)，女，福建安溪人，硕士研究生，研究方向为作物遗传育种，(E-mail)280594606@qq.com

高文伟(1973-)，男，陕西乾县人，教授，研究方向为作物遗传育种，(E-mail)280594606@qq.com 陈跃华(1958-)，男，新疆昌吉人，研究员，研究方向为油菜遗传育种与栽培，(E-mail)chenyuehua158576 @ sina.com

S565.4

：A

：1001-4330(2017)08-1437-07

Supported by: Autonomous research and development plan for high technology "Application of molecular marker assisted hybrid breeding technique for Brassica napus in Xinjiang" (201311109)