反相高效液相色谱法测定花生中的β-谷甾醇

张志舟，蔡大川，郑家概，张 飞，王和平，许泽群，丁少曼，陈 轶，蔡群娣，梁柳咏

(中国广州分析测试中心 广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东 广州 510070)

反相高效液相色谱法测定花生中的β-谷甾醇

张志舟，蔡大川，郑家概，张 飞，王和平，许泽群，丁少曼，陈 轶，蔡群娣，梁柳咏

(中国广州分析测试中心 广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东 广州 510070)

建立了测定花生中β-谷甾醇的反相高效液相色谱法。样品经过氢氧化钾—乙醇皂化提取后，采用高效液相色谱法进行含量测定。色谱条件为：C18柱(4.6 mm×250 mm，5μm)；流动相为乙腈/异丙醇=50/50；流速1.0 mL/min；紫外检测器：波长210 nm；进样量10μL，外标法定量。结果表明：β-谷甾醇在5.0～250 mg/L范围内线性良好，线性相关系数为0.9999，方法回收率为90%～103%，RSD为3.74%，检出限为3.0 mg/kg。本方法准确、重复性好、灵敏度高，可用于花生中β-谷甾醇的含量测定。

β-谷甾醇；花生；高效液相色谱法

花生作为一种主要油料作物，广泛种植于温带和热带地区。我国花生产量居于世界第一，全国各地都可以种植，其中我国50%～60%的花生用于榨油[1]。花生仁营养丰富，含有多种功效成分，主要包括植物甾醇、天然维生素E、蛋白质等，其中植物甾醇中β-谷甾醇含量最高[2]。

β-谷甾醇是以环戊烷全氢菲为骨架的一种类固醇化合物，广泛存在于动植物细胞膜中[3]。研究表明：β-谷甾醇是一种重要的药物原料，具有较为广泛的药理活性，它不仅可以降低胆固醇、抑制肿瘤、抗菌抗炎、调节免疫力等功效，还可以保养皮肤，延缓皮肤角质化[4-9]。此外，β-谷甾醇还广泛用于纺织柔软剂、颜料分散剂和汽油乳化剂等方面。

目前，现行的国家标准方法主要采用气相色谱法检测β-谷甾醇，还没有相关的液相色谱方法[10]。本实验参照β-谷甾醇标准方法的前处理过程，建立了反相高效液相色谱法测定花生中的β-谷甾醇检测方法，为筛选富含β-谷甾醇的花生品种提供方法支持，也为其它坚果中β-谷甾醇的检测提供技术参考。

1 实验部分

1.1 实验仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪-紫外检测器(VWD)(安捷伦科技(中国)有限公司)；电热恒温水浴锅(广东环凯微生物科技有限公司)；R-210旋转蒸发仪(瑞士BUCHI实验室仪器公司)；KQ-2200型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)； XFB-200高速中药粉碎机(吉首市中诚制药机械厂)；BT125D电子天平(Sartorius)；UV-2450紫外分光光度计(岛津企业管理(中国)有限公司)。

1.2 标准与试剂

β-谷甾醇(≥98.0%，北京中科质检生物科技有限公司)；氢氧化钾(广州化学试剂厂，分析纯)；乙腈(Honeywell色谱纯)；异丙醇(天津市富语精细化工有限公司 色谱纯)；无水乙醇(广州化学试剂厂，分析纯)；正己烷(广州化学试剂厂，分析纯)；去离子水；无水硫酸钠(广州化学试剂厂，分析纯)。

1.3 标准溶液配制

准确称取β-谷甾醇对照品0.02553 g于50.0 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解定容，作为标准储备液。

1.4 样品前处理

将晒干后的花生样品，去壳，用高速粉碎机粉碎。

样品皂化：准确称取样品约2.0 g于250 mL平底烧瓶中，加入30 mL无水乙醇混合均匀，再加10mL 50%氢氧化钾溶液，置于80℃水浴锅中皂化回流50min，皂化后立即放入冰水浴中冷却。

样品萃取：将上述溶液转移至500 mL分液漏斗中，用60 mL的去离子水分3次清洗平底烧瓶的残留物，洗液一并倒入分液漏斗中，加入50 mL正己烷，震摇萃取3min，静置分层，将下层水相溶液转移到另外一个分液漏斗中，再重复萃取两次，合并上层正己烷。用去离子水洗至中性。

过滤：将洗至中性的正己烷过装有适量无水硫酸钠的滤纸，滤液装在200 mL三角瓶内，用少量正己烷洗涤无水硫酸钠及滤纸合并于滤液。

浓缩定容：将滤液用氮气在30℃旋转蒸发至干，准确加入10 mL甲醇，在超声波清洗器中轻摇超声溶解残留物，摇匀后，溶液过0.45μm滤头，滤液供液相色谱上机测试。

1.5 色谱条件

色谱柱：月旭C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温40 ℃；检测波长：波长210 nm，流动相：乙腈/异丙醇=50/50。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法的选择

目前，关于β-谷甾醇的前处理方法主要有皂化提取法、索氏提取法和超声波提取法[11-12]。 如果样品中β-谷甾醇的来源是人为添加的，则首选索氏提取法和超声波提取法。皂化提取法适用于天然的、油脂含量较高的样品。由于花生中蛋白质、粗脂肪、硬油脂、脂肪酸的含量较高[13]，所以本实验选用皂化提取法。花生经过皂化提取后，不仅可以充分提取天然β-谷甾醇，而且还可以除去基质中蛋白质和脂肪酸的干扰。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 检测波长的选择

采用紫外可见分光光度计在190～400 nm范围内对50 mg/L的β-谷甾醇的标准溶液进行光谱扫描，可知β-谷甾醇在紫外区最大吸收波长为210 nm，因此选择210 nm作为检测波长。

2.2.2 流动相的选择

采用高效液相色谱测定β-谷甾醇时，常用流动相体系主要有：乙腈-异丙醇，甲醇-水体系。由于甲醇在210 nm吸收较强，有较大的背景干扰，对基线影响较大，因此，本实验选择乙腈-异丙醇体系。本实验分别考察了乙腈-异丙醇(70∶30)、乙腈-异丙醇(50∶50)和乙腈-异丙醇(30∶70)对β-谷甾醇分离的影响。结果表明流动相为乙腈-异丙醇(50∶50)时，分离度能够到达日常检测需求，色谱峰形较好，出峰时间合适，作为最终流动相。标准色谱图见图1。

图1 标准溶液的液相色谱图

Fig.1 Chromatogram of standard solution

2.3 花生中β-谷甾醇的测定

花生的前处理过程见“1.4”，制得样品提取液，过滤上机测定，色谱条件同“1.5”，得到的样品色谱图见图2。

图2 花生样品的液相色谱图Fig.2 Chromatogram of peanut sample

2.4 线性范围

用无水乙醇将β-谷甾醇标准储备液稀释成浓度分别为5.0、10.0、50.0、100.0、250.0mg/L，进行测定，以β-谷甾醇标准系列浓度(X)为横坐标，相应的色谱峰面积为纵坐标(Y)，得到的线性方程为Y=21.844X-8.114，R2=0.9999，可知β-谷甾醇在5.0～250.0 mg/L范围内，线性良好。β-谷甾醇的检出限为3.0 mg/kg(信噪比S/N=3)。

2.5 精密度试验

选定浓度为50 mg/L的β-谷甾醇标准工作液，进样量为10 μL，连续进样6次，求得相对标准偏差RSD为2.58%，仪器的精密度良好。

2.6 重复性实验

准确称量花生样品6份，按照“1.4”进行样品前处理，进行测定，求得相对标准偏差(RSD)为3.74 %，方法重复性良好。

2.7 加标回收率

准确称取样品6份，加入β-谷甾醇标准储备液，加标量为50 mg/100 g。按照“1.4”进行处理，采用外标法定量，求得样品加标回收率为90 %～103 %。方法的准确度较好，可满足测定要求。

3 结论

本研究建立了花生中β-谷甾醇的反相高效液相色谱测定方法。该方法适用于花生中β-谷甾醇的提取测定，方法准确性良好，灵敏度高，可为筛选富含β-谷甾醇的花生品种提供方法支持，也可为其它坚果中β-谷甾醇的检测提供技术参考。

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[2] 张建书,王 强,刘红芝,等.不同地区花生品种VE、植物甾醇组成与含量的分析比较[J]. 食品科学,2012,33(22):191-195.[3] 袁金伟,王 帆,买文鹏,等.β-谷甾醇的结构修饰研究进展[J].河南工业大学学报(自然科 学版),2015,36(2):107-112.

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[13] 殷冬梅,张幸果,王 允,等.花生主要品质性状的主成分分析与综合评价[J].植物遗传资源学报, 2011,12(4):507-512,518.

(本文文献格式：张志舟，蔡大川，郑家概，等.反相高效液相色谱法测定花生中的β-谷甾醇[J].山东化工,2017,46(5):80-82.)

Determination of β-sitosterol in Peanut by Reversed-Phase High Performance Liquid Chromato Graphy

ZhangZhizhou,CaiDachuan,ZhengJiagai,ZhangFei,WangHeping,XuZequn,DingShaoman,ChenYi,CaiQundi,LiangLiuyong

(Guangdong Provincial Key Laboratory of Emergency Test for Dangerous Chemicals, China National Analytical Center(Guangzhou),Guangzhou 510070,China)

A new method for determination of β-sitosterol in peanut by reversed-phase high performance liquid chromatography.Peanuts were analyzed by high performance liquid chromatography after saponification with KOH- ethanol solution.The separation of β-sitosterol was conducted on a C18column (4.6 mm×250 mm，5μm ) with the mobile phase of acetonitrile and isopropanol(50/50).The flow rate was 1.0 mL/min and injection volume was 10μL. The detection wavelength was 210 nm and quantified by the external standard method.The linearity were obtained in the range of 5.0～250 mg/L with correlation coefficients 0.9999.The average recoveries of samples was in the range of 90%-103% and RSD was 3.74%. The determination of limit was 3.0mg/kg. The results indicate that the method is accurate 、reliable and reproducibility in the analysis of peanut.

β-sitosterol;peanut;high-performance liquid chromatography (HPLC)

2016-01-12

张志舟(1988—)，男，广东肇庆人，本科，助理工程师。

O657.7

A

1008-021X(2017)05-0080-03