灵芝糖蛋白与人源蛋白RANKL胞外结构域的相互作用

习雪丽，汪劲松，张新潮，王卫东，柳亚鹏，潘继承

(湖北师范大学 生命科学学院，湖北 黄石 435002)

灵芝糖蛋白与人源蛋白RANKL胞外结构域的相互作用

习雪丽，汪劲松，张新潮，王卫东，柳亚鹏，潘继承

(湖北师范大学 生命科学学院，湖北 黄石 435002)

采用酶辅助超声提取法，利用DEAE-Sephadex A25 离子层析分离得到一种天然灵芝糖蛋白GP2。经SDS-PAGE检测，以高碘酸希夫试剂染色得到单一条带，说明此组分为单一糖蛋白，红外检测分析证实此组分(GP2)为糖蛋白。荧光检测结果表明，此糖蛋白导致人源RANKL胞外结构域(eRANKL)内源荧光减弱，ANS荧光增强，推测此组分可能会使该蛋白构象发生改变。

灵芝；糖蛋白；纯化；人源RANKL胞外结构域

灵芝是一种营养，保健价值极高的大型担子菌，其所含多糖类具有抗肿瘤生长、减少化疗毒副作用、镇静安神、提高机体免疫力、强心、降血脂血压、保护肝脏、降血糖、抗氧化、抗衰老等作用[1]。为提高多糖的提取率，目前大多在提取前对灵芝子实体或菌丝体采取预处理。方法有微波处理法、酶法、超声波法、冷冻法等。探究灵芝多糖对肿瘤细胞的药理学活性，进一步探索其药效机制，近年来，已成为炽手可热的研究课题，而多糖与机体功能性蛋白相互作用的研究，势必为多糖生物活性的探讨提供生化水平的佐证，为细胞水平靶蛋白的寻找提供实验依据。

细胞核因子κB受体活化因子配体(Receptor Activator of Nuclear Factor-κ B Ligand, RANKL)是一种II型跨膜蛋白，由一简短N-端胞质结构域和一类似TNF(tumor necrosis factor，肿瘤坏死因子)核心胞外保守结构域组成，属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员，主要表达于激活的T细胞，骨髓干细胞及成骨细胞[2-3]，在成骨细胞、骨髓基质细胞、软骨基质周围肥大型软骨细胞中亦有表达。RANKL是一种强效破骨因子，通过与巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)结合，诱导破骨细胞的形成。文献报道，RANK与RANKL强的相互作用是RANK/RANKL信号通路及破骨细胞形成的必备条件，轻微干扰二者的相互结合即可对破骨细胞的形成产生显著影响[3]。RANKL-RANK异源六聚体是通过三个RANK单体分别插入一个RANKL三聚体相邻单体间的缝隙而形成，可见RANKL三聚体的存在形态对其功能具有至关重要的作用。RANKL除了在骨相关疾病中有重要作用，在免疫系统，体温调节，癌症转移，妊娠期及荷尔蒙诱导的乳腺的发育中同样至关重要。有理由相信，RANKL是一种治疗相关疾病的重要靶点[4]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

含有pET-21b-RANKL的E.coli BL21菌种，由本实验室构建并保存；LB培养基(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，pH值7.0)；灵芝购自云南海南；蛋白胨，酵母提取物购自OXIOD，IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)、Amp(氨苄青霉素)、Kan(卡那霉素)均为国产分析纯，DEAE纤维素柱(二乙氨基乙基纤维素)购自上海宝曼生物科技有限公司。

1.2 实验仪器

1.3 实验方法

eRANKL蛋白质的制备：取本实验室已构建成功的含有pET-21b-RANKL的E.coli BL21甘油菌20 μL接种于6 mL的LB试管培养基(已加入氨苄，工作浓度为100 μg/mL)，置于37 ℃摇床，恒温培养12 h；向大体积LB培养基中加入0.5%已活化好的菌液，置于37 ℃摇床，恒温培养2～3 h；扩大培养至菌液OD值在0.6～0.8之间时，向菌液中加入IPTG使其工作浓度为0.2 mmol/L，置于20 ℃摇床，恒温培养12 h；将诱导后的菌液离心(5000 r/min，10min)收集细胞沉淀，以蒸馏水洗沉淀一次；将细胞沉淀重悬于细胞裂解液中，于冰浴中超声破壁，于4 ℃，离心(12000 r/min，10min)，取上清，即为粗蛋白提取液；采用His-tag/Ni亲和层析方法纯化，SDS-PAGE，Western blot检测。

灵芝多糖的提取与纯化：取干灵芝50 g，粉碎，醇沉24 h，抽滤，向沉淀中按m(灵芝)∶v(水)= 1∶20的比例加水混匀，并向混合液中加入0.06%木聚糖酶，置于55 ℃摇床中，酶解1 h，超声破壁，置78 ℃水浴3 h；离心, 取上清，并向其中加入4倍体积工业酒精，4 ℃醇沉24 h，离心，取沉淀，即得粗糖；向粗糖中加入适量二次蒸馏水，78 ℃水浴30 min，抽滤，DEAE-Sephadex A25 离子层析，以Tris-HCl(pH值=7.0)为缓冲液，NaCl浓度梯度洗脱液，收集；用SDS-PAGE(12%分离胶，5%浓缩胶)进行多糖检测，以高碘酸希夫试剂染色；灵芝多糖的红外光谱检测。将所得GP2以KBr压片，通过红外光谱仪扫描，扫描范围4000～400 cm-1。

灵芝多糖与人源eRANKL胞外结构域的荧光光谱检测：终浓度为15 μmol/L的eRANKL与不同浓度的糖蛋白于37 ℃恒温水浴30min，激发波长295 nm，扫面波长范围300～400 nm，测定其内源荧光。ANS荧光检测：向上述体系中各加入1～3 μL ANS(蛋白浓度约为ANS浓度的25倍)，避光反应30 min，参数设定为激发波长380 nm，扫描波长范围400～600 nm，测定ANS荧光光谱。

2 结果

2.1 Western blot 鉴定重组RANKL胞外结构域

结果如图1所示，表明eRANKL基因已经表达，其蛋白已纯化。

1.标准蛋白；2.eRANKL；3. eRANKL/Western blot图1 人源eRANKL胞外结构域SDS-PAGE及 Western blot结果

2.2 灵芝糖蛋白经DEAE-Sephadex A25纯化

图2 灵芝糖蛋白经DEAE-Sephadex A25纯化的洗脱曲线

取经过脱蛋白，透析及离心处理的粗多糖，上样，以Tris-HCl(pH值为7.0)为缓冲液，先后以0.1、0.3、0.5、0.8 mol/L NaCl为洗脱液，结果如图2所示。

结合苯酚-硫酸法检测知[5]，由0.3 mol/L NaCl洗脱所得多糖的总糖含量最大，将此组分命名为GP-2，结合考马斯亮蓝法测得，此组分中m总糖∶m蛋白质= 40∶1，在经过20次脱蛋白处理后，仍有蛋白尚存，推测此蛋白可能是稳定结合在多糖上的多肽类物质[6]，后续实验以此组分作为主要研究对象。

认知因素主要包括儿童对社会性行为的认识和对情景信息的识别等。近年来，国外的一系列研究揭示了儿童的社会认知特别是对突然行为意图的认知对儿童攻击性行为的调节作用。当儿童把自己所面临的消极后果知觉为同伴有意造成的时候，一般倾向于对同伴做出报复性攻击；反之，如果认为同伴是由于意外或出于善意的动机而给他造成了消极后果时，一般倾向于消释其恶意认定。同时，攻击性与非攻击性儿童对他人行为意图认知存在着差异，攻击性儿童在他人行为意图不明时倾向于做出敌意性归因。

2.3 灵芝糖蛋白的SDS-PAGE检测

取GP-2经SDS-PAGE电泳，以高碘酸西弗试剂染色，得一单一条带[7]，证明所得GP-2可能为纯多糖或糖蛋白，电泳图谱如图3。

图3 灵芝糖蛋白的SDS-PAGE经高碘酸西弗试剂染色

2.4 灵芝糖蛋白的红外光谱检测

由DEAE纤维素柱纯化所得GP-2，经对水透析，真空冷冻干燥等处理后所得干粉GP-2以KBr压片，经过红外光谱仪扫描，得到图谱如图4所示。

图4 灵芝糖蛋白的红外光谱图

在3600～3200 cm-1之间有一强峰，说明存在着分子内或分子间氢键O-H的伸缩振动；在3000～2800 cm-1之间有一强峰是糖类C-H伸缩振动；在1637.4 cm-1是CH3CONH-的酰胺I谱带；1400～1200 cm-1之间的峰是C-H的变角振动，；880.7 cm-1处的特征吸收，说明此糖为β-D-甘露吡喃糖[8]。

2.5 灵芝糖蛋白与人源RANKL胞外结构域的荧光谱分析

eRANKL终浓度为15μmol/L，曲线1至6的糖蛋白的浓度分别为0, 4, 8, 12, 16, 20 mg/mL

图5 灵芝糖蛋白与重组人源RANKL胞外结构域相互作用的

内源荧光光谱

eRANKL终浓度为15μmol/L，曲线2至7的糖蛋白的浓度分别为0, 4, 8, 12, 16, 20 mg/mL，曲线1为ANS对照

图6 灵芝糖蛋白与重组人源RANKL胞外结构域相互作用的

ANS荧光光谱

灵芝糖蛋白与重组人源RANKL胞外结构域相互作用的内源荧光光谱如图5所示，ANS荧光检测结果如图6所示。

由图5可知：灵芝糖蛋白的加入使得RANKL胞外结构域的荧光强度降低，且呈剂量依赖关系，表明灵芝糖蛋白的加入有可能使得RANKL胞外结构域的色氨酸的微环境发生了改变。

由图6可知：灵芝糖蛋白的加入使得RANKL胞外结构域的ANS荧光强度增强，且呈剂量依赖关系，说明糖蛋白的加入促进了RANKL胞外结构域疏水面，推测蛋白结构有可能变得更疏松。

3 讨论

本研究选用木聚糖酶辅助超声破壁的方法提取灵芝多糖，不单缩短了提取多糖所需时间，也提高了多糖的得率，且获得的多糖纯度较高。荧光光谱学研究结果表明，灵芝糖蛋白可以导致eRANKL构象改变，进而干预RANKL与其受体RANK结合，因此灵芝多糖有望成为以RANKL/RANK信号通路为靶点的天然无毒副作用新药，值得进一步研究。

[1] Yang F,Liu C．The influence of environmental conditions on polysacchafides fomation by Ganoderma lucidum in submerged fermentations[J].Process Biochemistry，1998，33: 547-553.

[2] Lam J,Nelson C A,Ross F P,et al.Crystal structure of the TRANCE/RANKL cytokine reveals determinants of receptor-ligand specificity[J].J Clin Invest,2001,108: 971-979.

[3] Ito S,Wakabayashi K,Ubukata O,et al.Crystal structure of the extracellular domain of mouse RANK ligand at 2.2-A resolution[J].J Biol Chem,2002,277: 6631-6636.

[4] Douni E,Rinotas V,Makrinou E,et al.A RANKL G278R mutation causing osteopetrosis identifies a functional amino acid essential for trimer assembly in RANKL and TNF[J]. Hum Mol Genet,2012,21:784-798.

[5] 张惟杰.复合多糖生化研究技术[M].上海:上海科技出版社,1994.

[6] Peng Yanfei,Zhang Lina.Characterization of a polysaccharide-protein complex from Ganoderma tsugae mycelium by size-exclusion chromatography combined with laser light scattering[J]J Biochem Biophys Methods,2003,56:243-252.

[7] Liu J,Yang F,Ye L B,et al.Possible mode of action of antiherpetic activities of a proteoglycan isolated from the mycelia of Ganoderma lucidum in vitro[J].Journal of Ethnopharmacology,2004,95:265-272.

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(本文文献格式：习雪丽，汪劲松，张新潮，等.灵芝糖蛋白与人源蛋白RANKL胞外结构域的相互作用[J].山东化工,2017,46(5):31-33.)

Studies on the Interaction Between Extracellular Domain of Human RANKL with Bioactive Glycoprotein

XiXueli,WangJinsong,ZhangXinchao,WangWeidong,LiuYapeng,PanJicheng

(College of Life,Hubei Normal University,Huangshi 435002,China)

Osteoprotegerin(OPG) and receptor activator of nuclear factor kappa B (RANK) are members of the TNFR superfamily that regulate osteoclast formation and function by competing for RANK ligand (RANKL). RANKL promotes osteoclast development through RANK activation,while OPG inhibits this process by sequestering RANKL. In this paper, a natural ganoderma glycoprotein was harvested by the means of ultrasonic assisted, enzymatic action and DEAE-Sephadex A25 ion chromatography. The homogeneous glycoprotein from ganoderma was identified by SDS-PAGE, stained with Acid-Schiff regent and infrared analysis. Fluorescence analysis indicated that the glycoprotein could result eRANKL intrinsic fluorescence intensity dropping and ANS fluorescence intensity increasing,which suggested the glycoprotein caused the eRANKL’s conformational change.

ganoderma;glycoprotein;purification;human extracellular domain of RANKL

2016-01-13

习雪丽(1987—)，女，湖北襄阳人，硕士研究生，研究方向：蛋白质结构与功能；通讯作者：潘继承，教授。

TQ936.22

A

1008-021X(2017)05-0031-03