柱前衍生法测定茶叶中L-茶氨酸的含量

□ 何沃权 莫永川 广州金域医学检验中心有限公司

柱前衍生法测定茶叶中L-茶氨酸的含量

□ 何沃权 莫永川 广州金域医学检验中心有限公司

本文研究了柱前衍生测定茶叶中L-茶氨酸含量的方法。茶叶中的L-茶氨酸用热水提取后，经2，4-二硝基氟苯衍生后上高效液相色谱法测定。色谱条件为：色谱柱（Kromasil C18柱 4．6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙 ︰磷酸盐溶液（pH=6．5）=15︰85梯度洗脱；检测波长：360 nm；流速：1．0 mL/min；柱温：35 ℃；进样：5 μL。本方法检出限4 mg/kg，在1．0～50．0 μg/mL呈现良好的线性关系（r=0．999 9），衍生后的样品室温25 ℃放置6天内稳定，重现性试验相对标准偏差0．16%（n=6），回收率为96．4%～102．2%。本高效液相色谱法可以准确地测定茶叶中L-茶氨酸的含量。

L-茶氨酸；柱前衍生；2，4-二硝基氟苯；高效液相色谱法

茶氨酸是茶叶中特有的非蛋白氨基酸，占茶树体内游离氨基酸的50%左右，约占茶叶干重的1%～2%[1]。由于茶原料、加工、制作方法的不同，茶氨酸在各类茶叶中含量有较大差异[2]。茶氨酸作为茶叶特有的化学成分之一，在提神、镇静、降血压、抗癌和减肥等方面都起到了有效的作用[3-6]。茶叶中的茶氨酸主要有L-茶氨酸和D-茶氨酸两种形式，而D-茶氨酸在茶叶中的茶氨酸占比很小[7]，可以忽略不计，而且国标中茶氨酸一般指L-茶氨酸[8]，所以本方法重点考查茶叶中的L-茶氨酸。目前，测定茶氨酸的方法包括紫外分光光度法、毛细管电泳法、高效液相色谱法等。高效液相色谱法能快速、准确的测定茶氨酸，是作为茶氨酸测定的常用分析方法，由于大多数氨基酸无紫外吸收和荧光发射，为了提高分析的灵敏度和分离选择性，通常将氨基酸衍生。目前，主要有邻苯二甲醛（OPA）衍生法，刘小力[9]就有详细研究；还有以异氰酸苯酯（PITC）柱前衍生，以紫外检测分析。1996年，郭升平老师对茶叶中的茶氨酸进行详细的研究[10]。由于OPA衍生法的衍生反应快，衍生物要求在一定时间内上机测定才能得到准确结果，对操作者的能力要求比较高；而异氰酸苯酯（PITC）衍生法，衍生化后形成的副产物较多，需要系统处理以避免干扰[11]。因此，本文以2,4-二硝基氟苯作为柱前衍生试剂，以C18色谱柱进行分离，以紫外作为检测器，对L-茶氨酸进行分析研究。结果证明本方法的检测灵敏度高、分离效果好、准确度高，适合茶叶中茶氨基酸的测定。

1 实验部分

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪，配DAD检测器；恒温振荡水槽（精宏）；CP225D 电子天平（Sartorius）；移液器（Finnpipette）：100～1 000 μL。

1.2 试剂

2,4-二硝基氟苯（山东西亚化工）；碳酸氢钠（广州化学试剂）；磷酸二氢钾、氢氧化钠、磷酸（广东化学试剂）；乙腈（默克 色谱级）。

1.3 试剂的配制

1%的2,4-二硝基氟苯溶液：取1 g 2,4-二硝基氟苯，加入100 mL乙腈溶解。0.5 mol/L碳酸氢钠溶液：取4.2 g碳酸氢钠，加入100 mL水溶解。10%氢氧化钠溶液：取10 g氢氧化钠，加入100 mL水溶解。pH=7.0磷酸盐溶液：取3.4 g磷酸二氢钾，用水900 mL溶解，用氢氧化钠溶液调pH=7.0后，加水定容至1 000 mL。

1.4 标准品

L-茶氨酸：纯度99%安谱。

1.5 标准溶液配制

L-茶氨酸标准储备液（2.000 mg/ mL）：准确称取L-茶氨酸标准品0.02 g（精确到0.01 mg），用水溶解并定容至10 mL。

L-茶氨酸标准中间液（100 μg/ mL）：准确移取L-茶氨酸标准储备液500 μL置10 mL容量瓶中，加水至刻度，即得。

标准曲线溶液配制。准确吸取L-茶氨酸标准储备液250 μL、100 μL，L-茶氨酸标准中间液1 000、500、200、100 μL和0 μL于不同的10 mL容量瓶中，分别加入1 mL 0.5 mol/L碳酸氢钠溶液、1 mL1%的2,4-二硝基氟苯溶液，密封好，混匀，至60 ℃热水中衍生1 h，取出，放冷，用pH=7.0磷酸盐溶液定容，过滤，即得标曲浓度0、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL和50.0 μg/mL。

1.6 色谱条件

色谱柱：KromasilC18柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）：25 mmol磷酸盐溶液（用氢氧化钠溶液调pH=6.5）=15︰85；梯度洗脱：0～10 min； A：15%→20% B：85%→80%；10~20 min A：20%→30% B：80%→70%; %；20~30 min A：30%→60% B：70%→40%；30~30.5 min A：60%→15% B：40%→85%。流速：1.0 mL/min；检测波长：360 nm；柱温：35 ℃；进样量：5 μL。

1.7 样品制备

1.7.1 样品提取

准确称取研细均匀的样品0.5 g，准确加入100 mL水，在80 ℃恒温振荡水槽中振荡提取45 min，冷却，过滤，滤液待用。

1.7.2 样品衍生

准确吸取样品滤液1 mL于10 mL容量瓶中，分别加入1 mL 0.5 mol/ L碳酸氢钠溶液、1 mL1%的2,4-二硝基氟苯溶液，密封好，混匀，至60℃热水中衍生1 h，取出，放冷，用pH=7.0磷酸盐溶液定容，过滤，上机。

2 结果与讨论

2.1 L-茶氨酸的定性和定量

本文考察了有机绿茶、毛尖、普洱茶、红茶几种不同成品茶叶的含量，见表1。由表1可以看出不同的茶叶含茶氨酸是不一样的，其中绿茶含量最高，红茶次之，普洱茶含L-茶氨酸最少。

图1、图2是标准品图和样品图，可以看出分离效果符合要求。

2.2 L-茶氨酸衍生条件实验

由于绿茶含茶氨酸较高，所以选择有机绿茶作为本方法学验证的茶叶。取同一个样品提取液，考察衍生时间比较（见表2)和温度比较（见表3），由表2和表3可以看出，样品在衍生时间60 min和衍生温度60 ℃时，基本衍生完成。

2.3 流动相pH条件实验

本方法考察了流动相磷酸盐的pH值在4.5、6.5、7.0情况下对L-茶氨酸出峰的影响。可以发现，pH=4.5时，L-茶氨酸出峰较晚，而且与衍生剂的峰分离不是很完全，会受其干扰；pH=6.5、pH=7.0时，L-茶氨酸出峰越快，而且与衍生剂的峰、杂质峰分离的比较好，同时为了保护色谱柱，选择pH=6.5作为本方法流动相。

2.4 样品衍生化后的稳定性考察实验

取经衍生化后的样品，在室温25℃下，考察其稳定性（见表4），可以看出衍生化后的样品至少可以保存6天，相对标准偏差RSD=0.36%。

2.5 L-茶氨酸的标准曲线、检出限实验

将已经衍生后的标准曲线溶液进样，用外标法定量分析，峰面积（y）与浓度（x）呈良好的线性相关性：

y=216.485 23x+15.971 36

r=0.999 96

以样品检出的最低浓度的3倍标准偏差作为检出限，得检出限为4 mg/kg。

2.6 样品的重复性实验和加标实验

取同一样品6份，按方法进行衍生上机后，得到L-茶氨酸的平均含量为1.31%，RSD=0.16%（见表5）。取样后加入一定量的标液，按方法处理、上机，得到回收率：96.4%～102.2%（见表6）。

2.7 L-茶氨酸的耐用性实验

考察了样品在流动相流速和柱温发生改变时对L-茶氨酸测定的影响。适当调整流动相的流速为0.8、1.2 mL/ min和柱温变为25、45℃时，杂质与目标峰都能很好的分离，对测定结果的影响不大。

表1 各种成品茶叶的含量表

图1 标准品图

图2 有机绿茶样品图

表2 衍生时间比较表

表3 衍生温度比较表

表4 稳定性考察表

表5 重复性实验表

表6 加标回收实验表

柱前衍生法对茶叶中L-茶氨酸的检测重现性好、灵敏度高、分离效果好、准确度高，适用于不同茶叶中茶氨基酸的测定。

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